माउस केंद्रीय तंत्रिका तंत्र के हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए एक सुविधाजनक गुरुत्वाकर्षण खिलाया छिड़काव विधि प्रस्तुत की जाती है। पार्किंसंस रोग के माउस मॉडल में फॉस्फोराइलेटेड α-सिन्यूक्लिन का इम्यूनोफ्लोरोसेंट डिटेक्शन प्रदर्शित किया जाता है। यह काम ट्रांसकार्डियल छिड़काव, विच्छेदन, ऊतक ठंड / एम्बेडिंग, और जमे हुए सेक्शनिंग चरणों का भी व्यापक रूप से वर्णन करता है।
चूहों से पृथक मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के नमूनों का हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण इस मॉडल प्रणाली में विकृति के मूल्यांकन के लिए आम बात है। इन नाजुक ऊतकों की आकृति विज्ञान को बनाए रखने के लिए, संवेदनाहारी जानवरों (ट्रांसकार्डियल छिड़काव) में हृदय के कैनुलेशन के माध्यम से पैराफॉर्मलडिहाइड जैसे रासायनिक फिक्सेटिव को प्रशासित करना नियमित है। माउस दिल के ट्रांसकार्डियल छिड़काव पारंपरिक रूप से इस प्रक्रिया के लिए आवश्यक खारा और फिक्सेटिव समाधान दोनों देने के लिए पेरिस्टाल्टिक पंप या हवा के दबाव के उपयोग पर निर्भर है। इन विधियों के लिए आसानी से सुलभ विकल्प के रूप में, यह काम इत्र वितरण की गुरुत्वाकर्षण-खिलाया विधि के उपयोग को दर्शाता है जो अधिकांश हार्डवेयर स्टोर में उपलब्ध सामग्रियों का उपयोग करता है।
इस नई छिड़काव विधि को मान्य करने के लिए, यह काम मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी दोनों में फॉस्फोराइलेटेड α-सिन्यूक्लिन के संवेदनशील पता लगाने के लिए आवश्यक सभी बाद के चरणों को प्रदर्शित करता है। इन चरणों में निश्चित मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों का विच्छेदन, ऊतकों के तेजी से ठंड / एम्बेडिंग और क्रायोसेक्शनिंग, और इम्यूनोफ्लोरोसेंट धुंधला होना शामिल हैं। चूंकि इस विधि के परिणामस्वरूप फिक्सेटिव का पूरे शरीर का वितरण होता है, इसलिए इसका उपयोग हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए अन्य गैर-न्यूरोनल ऊतकों को तैयार करने के लिए भी किया जा सकता है।
माउस केंद्रीय तंत्रिका तंत्र (सीएनएस) में विकृति विज्ञान का हिस्टोलॉजिकल लक्षण वर्णन एक नियमित तकनीक है जिसका उपयोग न्यूरोडीजेनेरेशन के अध्ययन में किया जाता है। चूंकि मृत्यु के बाद न्यूरोनल ऊतक तेजी से नीचा दिखाते हैं, इसलिए उनकी आकृति विज्ञान 1,2 को संरक्षित करने के लिए सीएनएस ऊतकों को पैराफॉर्मलडिहाइड जैसे रासायनिक फिक्सेटिव देने के लिए यह आम बात है। रासायनिक निर्धारण या तो एक फिक्सेटिव समाधान के साथ पूरे शरीर के छिड़काव के माध्यम से या ऊतकों के अलगाव और एक फिक्सेटिव समाधान में उनके विसर्जन के माध्यम से किया जा सकता है (जिसे “ड्रॉप फिक्सेशन” कहा जाता है)। छिड़काव फिक्सेटिव डिलीवरी का पसंदीदा तरीका है, क्योंकि ड्रॉप फिक्सेशन गहरी सीएनएस संरचनाओं 3,4,5 में फिक्सेटिव समाधान के तेजी से प्रवेश की अनुमति नहीं दे सकता है। इसके अलावा, चूंकि कशेरुक स्तंभ से अनफिक्स्ड रीढ़ की हड्डी को हटाना मुश्किल है, छिड़काव के माध्यम से फिक्सेटिव समाधान की डिलीवरी रीढ़ की हड्डी के सूक्ष्म और सकल शरीर रचना विज्ञान के सीटू संरक्षण की अनुमति देती है और हटाने के दौरान क्षति को कम करने के लिए ऊतक को कठोर करती है।
निर्धारण के लिए आवश्यक बफर और फिक्सेटिव समाधानों की डिलीवरी आमतौर पर व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पंपों या हवा के दबाव का उपयोग करके की जाती है। इत्र की गुरुत्वाकर्षण डिलीवरी निम्नलिखित कारणों से पंप डिलीवरी के विकल्प के रूप में काम कर सकती है: (1) पंप या एयर प्रेशर डिलीवरी कुछ मामलों में उपयोगकर्ता को छिड़काव के दौरान सिस्टम में मैन्युअल रूप से दबाव बनाए रखने की आवश्यकता हो सकती है। इत्र की गुरुत्वाकर्षण डिलीवरी उपयोगकर्ता के हस्तक्षेप के बिना बनाए रखी जा सकती है। (2) मानक वैज्ञानिक विक्रेताओं से उपलब्ध सामग्री प्राप्त करके उपयोगकर्ता को कम लागत पर गुरुत्वाकर्षण-वितरित इत्र उपकरण का निर्माण किया जा सकता है। यह काम बताता है कि धोने की बोतलों और विनाइल टयूबिंग का उपयोग करके एक साधारण गुरुत्वाकर्षण छिड़काव डिवाइस का निर्माण कैसे किया जाए। पार्किंसंस रोग के माउस मॉडल का उपयोग करते हुए, यह काम जमे हुए सेक्शनिंग के लिए उनके अलगाव से पहले मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी के ऊतकों को सुगंधित करने में इस प्रणाली की प्रभावकारिता को दर्शाता है। यह काम व्यापक रूप से जानवर से बाहर निश्चित ऊतक को विच्छेदित करने के लिए आवश्यक सभी चरणों, तकनीकों और सामग्रियों का वर्णन करता है, ऊतक को तेजी से फ्रीज / एम्बेड और क्रायोसेक्शन करता है, और अप्रत्यक्ष इम्यूनोफ्लोरेसेंस माइक्रोस्कोपी के माध्यम से मस्तिष्क और रीढ़ की हड्डी दोनों में फॉस्फोराइलेटेड α-सिन्यूक्लिन की उपस्थिति का पता लगाता है।
यह कार्य ट्रांसकार्डियल छिड़काव करने के लिए महत्वपूर्ण चरणों का वर्णन करता है। छिड़काव तंत्र (प्रोटोकॉल अनुभाग 1) का निर्माण करते समय, ट्यूबिंग का उपयोग करना महत्वपूर्ण है जो हेमोस्टैट द्वारा पूरी तरह से रोके जाने के लिए पर्याप्त लचीला है। कुछ कठोर टयूबिंग को हेमोस्टैट द्वारा पर्याप्त रूप से रोका नहीं जा सकता है और अभी भी प्रारंभिक पीबीएस छिड़काव के दौरान पीएफए को मुख्य लाइन में रिसाव करने की अनुमति दे सकता है। 4% पीएफए समाधान तैयार करते समय, यह सुनिश्चित करना महत्वपूर्ण है कि पीएच शारीरिक है (7.4)। चूंकि पीएफए समाधान की तैयारी में इसे 65 डिग्री सेल्सियस तक गर्म करना शामिल है, इसलिए समाधान को पीएच को मापने से पहले 25 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा किया जाना चाहिए क्योंकि यह वह तापमान है जिस पर पीएच मीटर पर कैलिब्रेट किया जाता है।
पेट में प्रारंभिक चीरा बनाते समय, पेट के अंगों (प्रोटोकॉल अनुभाग 2) के घाव से बचने के लिए देखभाल की जानी चाहिए। डायाफ्राम की ओर बेहतर विच्छेदन करते समय, यकृत के घाव से बचना महत्वपूर्ण है क्योंकि यकृत के लिए पूर्वकाल पेट की दीवार के साथ अनुयायी होना आम है। इस पर काबू पाने के लिए, डायाफ्राम की ओर चीरा जारी रखने से पहले यकृत को सावधानीपूर्वक और स्पष्ट रूप से पूर्वकाल की दीवार से विच्छेदित किया जाता है। डायाफ्राम के माध्यम से वक्ष गुहा में प्रवेश करते समय, हृदय, महान वाहिकाओं और फेफड़ों के घाव से बचना महत्वपूर्ण है। इससे बचने के लिए, कैंची टिप को सतही रूप से और रिबकेज के साथ एक तीव्र कोण पर रखा जाता है।
दिल को बेनकाब करने के लिए प्रारंभिक विच्छेदन प्रारंभिक चीरा से लगभग 2 मिनट लेता है। उम्मीद की जा रही है कि इस दौरान तितली सुई की नोक में कुछ हवा घुस गई है। माउस के परिसंचरण में इस हवा की शुरूआत खराब गुणवत्ता वाले छिड़काव का उत्पादन करेगी। इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि मुख्य रेखा खोली जाए और हवा के बुलबुले को हटाने के लिए दिल के कैनुलेशन से तुरंत पहले पीबीएस को सुई के माध्यम से फ्लश किया जाए। आदर्श रूप से, एलवी पंचर करते समय हवा की पूर्ण अनुपस्थिति सुनिश्चित करने के लिए एक छोटा पीबीएस ट्रिकल सुई टिप के माध्यम से बहता है, जबकि दिल को कैनुलेट किया जाता है।
जब सुई एलवी में प्रवेश करती है, तो इसे इतनी गहरी नहीं जाना चाहिए कि सुई टिप को दाहिने वेंट्रिकल (आरवी) में पेश किया जा सके। आरवी में या माइट्रल वाल्व से परे सुई की नियुक्ति के परिणामस्वरूप छिड़काव शुरू होने पर फेफड़ों की तत्काल “मुद्रास्फीति” होगी। यह अवांछनीय है, और एलवी प्लेसमेंट सुनिश्चित करने के लिए सुई को थोड़ा वापस लिया जाना चाहिए। यदि सुई को ठीक से रखा जाता है, तो फेफड़े छिड़काव के दौरान सपाट रहेंगे। जब छिड़काव शुरू किया जाता है, तो कभी-कभी यह देखा जाता है कि जानवर के खुले मुंह से एक स्पष्ट तरल उभर रहा है। यह आमतौर पर छिड़काव दबाव के कारण होता है जो बहुत अधिक होता है या हृदय के भीतर सुई के गलत स्थान के कारण होता है। लेखकों का अनुमान है कि ऊंचे छिड़काव दबाव के परिणामस्वरूप धमनी केशिका बिस्तर से इत्र का बहिर्वाह होता है और अन्नप्रणाली और मौखिक गुहा में ब्रोन्कियल पेड़ के माध्यम से पीबीएस का प्रतिगामी प्रवाह होता है।
छिड़काव दबाव को या तो पीबीएस बोतल में पीबीएस के स्तर को कम करके या पीबीएस बोतल की ऊंचाई को कम करके कम किया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, यदि सुई को बाएं वेंट्रिकल में बहुत गहराई से रखा जाता है, तो यह माइट्रल वाल्व के माध्यम से यात्रा कर सकता है और बाएं आलिंद में इत्र वितरित कर सकता है। इसके परिणामस्वरूप फुफ्फुसीय नसों के माध्यम से प्रतिगामी प्रवाह हो सकता है और धमनियों में इत्र का बहिर्वाह हो सकता है, जैसा कि ऊपर वर्णित है। पीबीएस के साथ संचार प्रणाली से रक्त की पूरी तरह से निकासी विशेष रूप से रक्त घटकों के फिक्सेटिव-प्रेरित क्रॉस-लिंकिंग से बचने के लिए महत्वपूर्ण है जिसके परिणामस्वरूप बाद में फिक्सेटिव छिड़काव पर पोत रोड़ा होता है। उदर पूंछ आधार में चीरा से यकृत और पीबीएस प्रवाह के रंग परिवर्तन द्वारा निकासी का प्रभावी ढंग से मूल्यांकन किया जाता है। रक्त निकासी आम तौर पर पीबीएस के साथ छिड़काव के 3 मिनट से पूरा हो जाता है; हालाँकि, यदि निकासी के दृश्य संकेत कम समय पर होते हैं, तो फिक्सेटिव को 3 मिनट से पहले पेश किया जाता है। लंबे समय तक निकासी समय की सिफारिश नहीं की जाती है क्योंकि विलंबित फिक्सेटिव छिड़काव सीएनएस ठीक संरचना में कलाकृतियों की ओर जाताहै 1.
जब पीएफए प्रशासित किया जा रहा है, तो पीएफए बोतल में पीएफए समाधान के स्तर की निगरानी करना महत्वपूर्ण है। यदि पीएफए का स्तर पीएफए बोतल के मुंह से 4 सेमी से कम हो जाता है तो पीएफए बोतल भरें। छिड़काव पूरा होने के बाद, छिड़काव तंत्र को आसुत जल से अच्छी तरह से धोया जाना चाहिए। यह महत्वपूर्ण है क्योंकि मुख्य लाइन में अवशिष्ट पीएफए पीएफए के साथ प्रारंभिक पीबीएस छिड़काव को दूषित कर देगा और इसके परिणामस्वरूप खराब गुणवत्ता वाला छिड़काव होगा। अंत में, 25 जी तितली सुइयों को आम तौर पर 20-30 ग्राम रेंज में औसत आकार के वयस्क चूहों के लिए अनुशंसित किया जाता है। हालांकि, बड़े या छोटे चूहों को इष्टतम प्रवाह दर प्रदान करने के लिए फिक्सेटिव बोतलों के समायोजन के अलावा थोड़ा बड़ा या छोटा गेज सुइयों की आवश्यकता हो सकती है।
सीएनएस विच्छेदन और ओसीटी एम्बेडिंग (प्रोटोकॉल अनुभाग 3) के लिए, रीढ़ की हड्डी के ऊतकों के लिए 30% सुक्रोज में पूरी तरह से डूबना आम बात है। इसलिए इन ऊतकों को 2 दिनों के लिए सुक्रोज में छोड़ दिया जाता है और फिर ओसीटी में एम्बेडेड किया जाता है, भले ही वे डूब जाएं या नहीं। ओसीटी में ऊतकों को ठंडा करते समय, यह संभव है कि ठंडा 2-मिथाइलब्यूटेन में रखे जाने पर कुछ ऊतक दरार कर सकते हैं। यह मस्तिष्क के साथ अधिक आम है और आमतौर पर तब होता है जब ऊतक पर बहुत अधिक ओसीटी रखा जाता है। इससे बचने के लिए, तत्काल ठंड से पहले ऊतक सतहों को कवर करने के लिए केवल पर्याप्त ओसीटी रखें। कुछ प्रोटोकॉल में, ओसीटी में पूर्ण विसर्जन के बावजूद क्रैकिंग कम आम है। यह आमतौर पर धीमी ठंड विधि के कारण होता है जैसे कि सूखी बर्फ-ठंडा 2-मिथाइलब्यूटेन का उपयोग करते समय या क्रायोमोल्ड को सीधे सूखी बर्फ के ब्लॉक पर रखना। तरल-नाइट्रोजन-ठंडा 2-मिथाइलब्यूटेन इस काम में पसंद किया जाता है क्योंकि ठंड की दर काफी अधिक तेज है और धीमी ठंड विधियों की तुलना में ऊतक आकृति विज्ञान को बेहतर ढंग से संरक्षित कर सकती है।
ऊतक (प्रोटोकॉल अनुभाग 4) क्रायोसेक्शन करते समय, कई फ्रीज-पिघलना चक्रों से बचना महत्वपूर्ण है। इसलिए, चयनित क्षेत्रों को विगलन और पुन: फ्रीज करने के बजाय विश्लेषण के लिए एक विशिष्ट मस्तिष्क क्षेत्र प्राप्त करने के लिए एक एकल ओसीटी ब्लॉक से सभी वर्गों को काटना इष्टतम है। यदि यह व्यवहार्य नहीं है, तो कुछ अनुभागों को प्राप्त करने के बाद, उपयोगकर्ता भविष्य के उपयोग के लिए -80 डिग्री सेल्सियस गहरे फ्रीजर में ओसीटी ब्लॉक को 1-2 बार फिर से फ्रीज और स्टोर कर सकते हैं।
इत्र के अधिक पारंपरिक पंप या वायु दाब वितरण पर इस पद्धति के प्रमुख लाभ निम्नानुसार हैं: (1) छिड़काव तंत्र की कम लागत और पहुंच। (2) उपयोगकर्ताओं को छिड़काव के दौरान छिड़काव तंत्र में मैन्युअल रूप से दबाव बनाए रखने की आवश्यकता नहीं है। (3) छिड़काव के लिए अन्य कम लागत वाले विकल्पों की तुलना में कम और अधिक सुसंगत छिड़काव दबाव जैसे सिरिंज वितरण के माध्यम से। बर्नौली के समीकरण का उपयोग करके, यह गणना की जाती है कि यहां निर्मित गुरुत्वाकर्षण-खिलाया छिड़काव उपकरण लगभग 73 मिमी एचजी के छिड़काव दबाव को बनाए रखेगा जब इत्र की बोतलों को सुई के सापेक्ष 1 मीटर ऊंचाई पर रखा जाता है। यह देखते हुए कि यह इन जानवरों के सिस्टोलिक रक्तचाप से काफी नीचे है, संवहनी टूटना12 से बचने के लिए यह छिड़काव दबाव पर्याप्त रूप से कम होने की संभावना है।
लेखकों ने पार्किंसंस रोग के माउस मॉडल में फॉस्फोराइलेटेड α-सिन्यूक्लिन की उपस्थिति का पता लगाने के लिए अब तक इस छिड़काव प्रणाली का सफलतापूर्वक उपयोग किया है। इस समय के दौरान, इस छिड़काव विधि के साथ महत्वपूर्ण सीमाओं का सामना नहीं किया गया है जो पंप छिड़काव वितरण विधि के साथ मौजूद नहीं हैं। इस तकनीक की प्रमुख सीमा छिड़काव बनाम ड्रॉप निर्धारण की समय लेने वाली प्रकृति है। सीएनएस संरचनाओं के लिए फिक्सेटिव के गहरे प्रवेश में छिड़काव परिणामों के रूप में निर्धारण को छोड़ने के लिए यह तकनीक बेहतर है। इस तकनीक की दूसरी सीमा यह है कि इसे प्रदर्शन करने के लिए कुछ सर्जिकल कौशल की आवश्यकता होती है, क्योंकि वक्ष गुहा में प्रवेश के बाद हृदय को जल्दी से कैनुलेट किया जाना चाहिए। हालांकि, अनुभव के साथ, प्रशिक्षित उपयोगकर्ता नियमित रूप से पेट में प्रारंभिक चीरा के 1 मिनट के भीतर दिल को कैनुलेट कर सकते हैं।
The authors have nothing to disclose.
लेखक इस प्रोटोकॉल को विकसित करने में उनकी सहायता के लिए ज़ियाओवेन वांग, लियाम कोयने और जेसन ग्रुलन को धन्यवाद देते हैं। इस काम को एनआईएच अनुदान एजी 061204 और एजी 063499 द्वारा समर्थित किया गया था।
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Triton X-100 | Us Biological | T8655 | |
Vetone Fluriso Isoflurane USP | MWI Animal Health | 502017 |