हम मच्छरों और फल मक्खियों में कीटनाशक संवेदनशीलता को मापने के लिए सामयिक अनुप्रयोग बायोएसे की कार्यप्रणाली और महत्व का वर्णन करते हैं। प्रस्तुत परख उच्च throughput है, कीट द्रव्यमान का उपयोग करता है-इस प्रकार एकाग्रता के बजाय एक बड़े पैमाने पर relativized घातक खुराक की गणना के लिए अनुमति देता है-और संभावना अन्य इसी तरह के तरीकों की तुलना में कम परिवर्तनशीलता है.
सार्वजनिक स्वास्थ्य और कृषि के लिए कीटनाशकों के निरंतर उपयोग ने व्यापक कीटनाशक प्रतिरोध और नियंत्रण विधियों को बाधित करने के लिए प्रेरित किया है। मच्छरों की आबादी की कीटनाशक प्रतिरोध निगरानी आमतौर पर रोग नियंत्रण और रोकथाम केंद्र (सीडीसी) बोतल बायोएसेस या विश्व स्वास्थ्य संगठन (डब्ल्यूएचओ) ट्यूब परीक्षणों के माध्यम से की जाती है। हालांकि, इन तरीकों के परिणामस्वरूप कीट के साथ चर कीटनाशक संपर्क के कारण मृत्यु दर के आंकड़ों में परिवर्तनशीलता की एक उच्च डिग्री हो सकती है, परीक्षण किए गए जीवों की अपेक्षाकृत छोटी संख्या, आबादी के बीच द्रव्यमान में व्यापक भिन्नता, और लगातार बदलती पर्यावरणीय स्थितियों, चर परिणामों के लिए अग्रणी। यह पेपर सामयिक अनुप्रयोग बायोएसे प्रस्तुत करता है, जो मच्छरों और फल मक्खियों दोनों के लिए एक उच्च-थ्रूपुट फेनोटाइपिक बायोएसे के रूप में अनुकूलित है, ताकि कीटनाशक सांद्रता की एक श्रृंखला के साथ बड़ी संख्या में कीड़ों का परीक्षण किया जा सके।
यह परख 1) हर जीव के साथ लगातार उपचार और कीटनाशक संपर्क सुनिश्चित करता है, 2) अत्यधिक विशिष्ट खुराक-प्रतिक्रिया घटता है कि उपभेदों और लिंगों के बीच औसत द्रव्यमान में अंतर के लिए खाते का उत्पादन करता है (जो क्षेत्र-एकत्र जीवों के लिए विशेष रूप से महत्वपूर्ण है), और 3) सांख्यिकीय रूप से कठोर औसत घातक खुराक (एलडी50) की गणना के लिए अनुमति देता है ), जो प्रतिरोध अनुपात तुलना के लिए आवश्यक हैं- नैदानिक खुराक मृत्यु दर से एक वैकल्पिक निगरानी दृष्टिकोण, जिसका उपयोग लार्विसाइड प्रतिरोध निगरानी के लिए भी किया जाता है। इस परख सटीक phenotyping मच्छर आबादी के लिए एक पूरक उपकरण होगा और, के रूप में फल मक्खियों का उपयोग कर सचित्र, आसानी से अन्य कीड़ों के साथ उपयोग के लिए अनुकूलनीय है. हम तर्क देते हैं कि यह परख कई कीट प्रजातियों में जीनोटाइपिक और फेनोटाइपिक कीटनाशक प्रतिरोध के बीच के अंतर को भरने में मदद करेगी।
मच्छर हर साल 700,000 से अधिक मौतों के लिए जिम्मेदार होते हैं, जो वे मनुष्यों को प्रसारित करते हैं, अकेले मलेरिया के कारण होने वाली मौतों में से आधे सेअधिक। मलेरिया और अन्य वेक्टर जनित रोगों के संचरण के खिलाफ मुख्य निवारक विधि कीटनाशकों का उपयोग है, अक्सर लंबे समय तक चलने वाले कीटनाशक जाल या इनडोर-अवशिष्ट छिड़काव के रूप में। हालांकि, कीटनाशक प्रतिरोध मच्छरों और अन्य कीट वैक्टरों के साथ-साथ कृषि कीटों के बीच व्यापक है, साथ ही साथ कृषि कीट 3,4। प्रतिरोध को प्रभावी ढंग से प्रबंधित करने के लिए, निगरानी महत्वपूर्ण महत्व की है5। इसके लिए, अत्यधिक सटीक और उच्च-थ्रूपुट प्रतिरोध का पता लगाने के तरीकों की आवश्यकता होती है। वर्तमान में, मच्छरों के लिए सबसे व्यापक कीटनाशक प्रतिरोध निगरानी उपकरण डब्ल्यूएचओ ट्यूब टेस्ट6 और सीडीसी बोतल बायोएसे7 हैं। फल मक्खियों के लिए अवशिष्ट संपर्क आवेदन विधि (सीडीसी बोतल bioassay के समान) एक आमतौर पर इस्तेमाल किया कीटनाशक bioassay 8,9,10 है. हालांकि, इन तरीकों से डेटा में परिवर्तनशीलता आमतौर पर उच्च होती है, सीडीसी बोतल एसेस में ~ 20-70% मृत्यु दर और डब्ल्यूएचओ ट्यूब परीक्षणों में 0-50% तक एक ही प्रयोगशाला मच्छर तनाव के माप के साथ जब सबलेथल खुराक11 के संपर्क में आता है। इस तरह की भिन्नता आश्चर्यजनक है क्योंकि अधिकांश प्रयोगशाला उपभेदों में सीमित आनुवंशिक भिन्नता से आबादी में सीमित कीटनाशक संवेदनशीलता भिन्नता होने की उम्मीद है। फिर भी, वहाँ अभी भी भिन्नता का एक उच्च स्तर bioassay परिणामों में मनाया जाता है.
इस भिन्नता के संभावित स्रोत सतह के माध्यम से अप्रत्यक्ष कीटनाशक जोखिम, विषम पर्यावरणीय प्रभाव, एक ही जीनोटाइप के व्यक्तियों के बीच सामान्य जैविक भिन्नता, और एक ही आबादी के नमूनों के द्रव्यमान में भिन्नता के कारण बायोएसे के भीतर नमूनों के बीच विषम कीटनाशक जोखिम का परिणाम हो सकते हैं। . उच्च replicability के साथ एक अक्सर इस्तेमाल की जाने वाली विधि सामयिक अनुप्रयोग bioassay है। इस परख में, कीटनाशक सीधे प्रत्येक कीट13,14 पर लागू किया जाता है, एक ही परख के भीतर विभिन्न नमूनों के विषम जोखिम के कारक को हटाने. हालांकि, इस विधि की धीमी-थ्रूपुट प्रकृति के कारण, यह नियमित रूप से मच्छर आबादी के लिए कीटनाशक संवेदनशीलता निगरानी उपकरण के रूप में उपयोग नहीं किया जाता है। यह पेपर सामयिक अनुप्रयोग बायोएसे के लिए एक संशोधित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है जो उच्च-थ्रूपुट एक्सपोज़र के लिए अनुमति देता है, जबकि कीट द्रव्यमान में भिन्नता के लिए भी सही करता है, एक पैरामीटर जो कीटनाशक संवेदनशीलता12 में परिवर्तन से संबंधित है। चर कीटनाशक जोखिम से मृत्यु दर के आंकड़ों में शोर और बड़े पैमाने पर संबद्ध भिन्नता में कमी अधिक सटीक तकनीकी प्रतिरोध निगरानी11,15 के लिए अनुमति देगी। इस तरह के डेटा का उपयोग आनुवंशिक मार्करों, फिटनेस पैरामीटर और / या वेक्टर क्षमता के साथ फेनोटाइपिक प्रतिरोध को अधिक सटीक रूप से जोड़ने के लिए किया जा सकता है। इसके अतिरिक्त, हम प्रदर्शित करते हैं कि कैसे इस परख को आसानी से अन्य कीट प्रजातियों के लिए अनुकूलित किया जा सकता है फल मक्खियों पर सामयिक अनुप्रयोग bioassay का उपयोग करके, एक छोटे शरीर कीट प्रजातियों.
उपर्युक्त अवशिष्ट संपर्क अनुप्रयोगों की मुख्य सीमा यह है कि कीटनाशक जोखिम एक ही परख के भीतर नमूने से नमूने तक भिन्न हो सकता है। सीडीसी बोतल bioassays और संपर्क विधि के मामले में, कीटनाशक जोखिम एक ही परख की प्रतिकृति के बीच भिन्न हो सकता है. कीटों को कीटनाशक के संपर्क में लाया जाता है जो या तो कांच की बोतल (सीडीसी बोतल बायोएसे और संपर्क विधि) के अंदर या गर्भवती कागजों (डब्ल्यूएचओ ट्यूब टेस्ट) पर वितरित किया जाता है। दोनों सतहों (कांच और कागज) पर कीटनाशक की एकाग्रता ज्ञात जीनोटाइप की विभिन्न प्रजातियों की स्क्रीनिंग द्वारा ज्ञात और पूर्व निर्धारित की जाती है। हालांकि, संभावित रूप से कीट द्वारा अवशोषित करने के लिए उपलब्ध राशि उपयोग की गई सतह, कीटनाशक मिश्रण घटकों के आधार पर बहुत भिन्न हो सकती है, और कीटनाशक को सतह सामग्री16,17 में कैसे सजातीय रूप से वितरित किया जाता है। सीडीसी बोतल बायोएसे में, बोतल के अंदर कीटनाशक कोटिंग प्रत्येक प्रयोगशाला और उपयोगकर्ता द्वारा नियोजित प्रक्रियाओं पर निर्भर करती है। डब्ल्यूएचओ ट्यूब टेस्ट में, कीटनाशक-उपचारित कागजात केंद्रीय रूप से उत्पादित होते हैं और इस प्रकार प्रयोगशालाओं में काफी सजातीय होने की संभावना होती है। हालांकि, डब्ल्यूएचओ ट्यूब टेस्ट में, एक्सपोजर ट्यूब नमूनों को गैर-कीटनाशक-उजागर धातु जाल पर उतरने और आराम करने की अनुमति देती है, जिससे प्रत्येक परीक्षण के भीतर नमूनों के बीच संभावित विषम कीटनाशक जोखिम होता है। कीटनाशक की वास्तविक मात्रा को उठाया गया और प्रत्येक विधि के माध्यम से नमूनों द्वारा अवशोषित किया गया, अभी भी आगे18 का पता लगाने की आवश्यकता है।
इसके अतिरिक्त, सीडीसी बोतल bioassay, WHO ट्यूब टेस्ट, और संपर्क विधि सबसे अधिक सीमा assays केवल एक पूर्व निर्धारित कीटनाशक एकाग्रता का परीक्षण के रूप में इस्तेमाल किया जाता है। यह दृष्टिकोण प्रतिरोध की उपस्थिति का सटीक रूप से पता लगा सकता है और प्रतिरोध निगरानी के लिए मूल्यवान है (खासकर जब प्रतिरोध फैल रहा है)। हालांकि, थ्रेशोल्ड एसेस प्रतिरोध की ताकत को निर्धारित नहीं कर सकता है, जो हस्तक्षेप उपकरणों की प्रभावकारिता का अधिक पूर्वानुमान हो सकता है। यदि इन विधियों के साथ कई कीटनाशक सांद्रता का उपयोग किया जाता है, तो उनका उपयोग तीव्रता के रूप में किया जा सकता है। सीडीसी बोतल bioassay और डब्ल्यूएचओ ट्यूब परीक्षण के लिए तीव्रता assays निगरानी 6,19 में इस अंतर को संबोधित करने के लिए 5x और 10x पूर्वनिर्धारित भेदभाव dosages का परीक्षण करके पेश किया गया है। प्रतिरोधी आबादी के बीच अंतर करने की अधिक क्षमता प्रदान करते हुए, 3-5 (पूर्व निर्धारित) खुराक घातक सांद्रता की गणना करने के लिए सीमित संकल्प प्रदान करते हैं। इसके अतिरिक्त, विभिन्न आकारों के मच्छरों का उपयोग इस तरह के assays में किया जाता है। फिर भी, द्रव्यमान को मापना महत्वपूर्ण है क्योंकि बड़े नमूनों को मारने के लिए उच्च खुराक की आवश्यकता हो सकती है क्योंकि द्रव्यमान की प्रति इकाई प्रभावी खुराक एक छोटे जीव12 की तुलना में बहुत कम होगी। एक बड़े पैमाने पर सापेक्षीकृत घातक खुराक (प्रति कीट द्रव्यमान कीटनाशक की मात्रा) की गणना अधिक सामान्य घातक एकाग्रता (उदाहरण के लिए, प्रति सतह क्षेत्र कीटनाशक की मात्रा) की तुलना में अधिक उपयोगी मीट्रिक होगी क्योंकि यह लिंगों, आबादी और जीनोटाइप के बीच कीट द्रव्यमान की भिन्नता पर विचार करता है। इस तरह के डेटा प्रयोगशाला और क्षेत्र के भीतर जीनोटाइपिक और फेनोटाइपिक प्रतिरोध के बीच के अंतर को भरने में मदद करेंगे और ज्ञात औसत द्रव्यमान के कीड़ों की आबादी का इलाज करने के लिए आवश्यक आवेदन एकाग्रता की गणना करने का एक आसान तरीका भी प्रदान कर सकते हैं।
बड़े पैमाने पर सापेक्षीकृत घातक खुराक का उपयोग जो 50% नमूनों (एलडी50) को मारता है, इसमें कई अन्य लाभ भी शामिल हैं। मिलीग्राम / किग्रा (= एनजी / मिलीग्राम) में एक विशिष्ट यौगिक की विषाक्तता का आकलन मानव और पशु चिकित्सा विष विज्ञान14 में मानक है, और एलडी50 मान सामग्री सुरक्षा डेटा शीट पर पाए जाते हैं। घातक खुराक भी एक विशेष प्रजाति की ओर विभिन्न रसायनों या विभिन्न प्रजातियों की ओर एक ही रसायन के बीच विषाक्तता की सीधी तुलना की अनुमति देतेहैं 20, साथ ही उपन्यास कीटनाशकों और रसायनों के उच्च गुणवत्ता वाले मूल्यांकन13। इसके अतिरिक्त, एलडी50 नैदानिक खुराक मृत्यु दर परिणामों से व्युत्पन्न लोगों की तुलना में अधिक सार्थक और सटीक प्रतिरोध अनुपात प्रदान कर सकता है, जिसके परिणामस्वरूप आबादी में मौजूद प्रतिरोध स्तर का एक अतिरेक हो सकता है। इसलिए, इस परख अन्य bioassays21 के लिए अनुशंसित की तुलना में अधिक नमूनों से व्युत्पन्न बड़े पैमाने पर relativized घातक खुराक के आधार पर अधिक कठोर प्रतिरोध निगरानी प्रदान करके नियमित निगरानी कार्यक्रमों के लिए उपयुक्त होगा.
सामयिक अनुप्रयोग विधि का उपयोग मच्छरों और मक्खियों के लिए कीटनाशक संवेदनशीलता निगरानी में मानक कीटनाशक संवेदनशीलता बायोएसेस के विकल्प के रूप में किया गया है जब प्रतिरोध पहले से ही ज्ञात या संदिग्ध22,23 है, साथ ही साथ कुछ कीट कीटों में निगरानी के लिए24 अधिक सटीक रूप से प्रतिरोध प्रोफाइल और कीटनाशक आंतरिक विषाक्तता का आकलन करनेके लिए 21 . सामयिक अनुप्रयोग bioassays में, कीटनाशक प्रत्येक जीव के लिए लागू किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप कीटनाशक जोखिम में न्यूनतम भिन्नता होती है। यह पेपर थोड़ा अनुकूलित और बेहतर विधि प्रस्तुत करता है जो कीटनाशक जोखिम को कम अवधि में बड़ी संख्या में कीड़ों पर लागू करने की अनुमति देता है, जबकि कीट द्रव्यमान22 के लिए भी नियंत्रित करता है। replicability के अच्छे स्तर के साथ इस उच्च-थ्रूपुट विधि नियमित कीटनाशक संवेदनशीलता निगरानी के लिए एक उपयोगी अतिरिक्त उपकरण हो सकता है।
यह पेपर मच्छरों और फल मक्खियों के लिए सामयिक आवेदन परख के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल प्रस्तुत करता है। इस प्रक्रिया को आसानी से क्षेत्र में और अन्य जीवों के साथ उपयोग करने के लिए अनुकूलित किया जा सकता है क्योंकि इसके लिए न्यूनतम विशेष उपकरणों की आवश्यकता होती है। नीचे संबोधित इस प्रोटोकॉल के महत्वपूर्ण चरणों, संभावित संशोधनों, समस्या निवारण सलाह, विधि की सीमाओं, और इस विधि के महत्व हैं।
प्रोटोकॉल में महत्वपूर्ण चरण: प्रोटोकॉल में तीन महत्वपूर्ण चरण हैं, जो गलत तरीके से पूरा होने पर, बायोएसे के परिणामों को काफी प्रभावित कर सकते हैं: कीटनाशक एकाग्रता सटीकता, नमूना नॉकडाउन और मृत्यु दर मूल्यांकन।
कीटनाशक एकाग्रता सटीकता:
replicable खुराक प्रतिक्रिया घटता और सार्थक परिणाम प्राप्त करने के लिए सटीक कीटनाशक समाधान होना बेहद महत्वपूर्ण है। कीटनाशक समाधान की तैयारी के लिए वॉल्यूमेट्रिक दृष्टिकोण सीडीसी बोतल बायोएसे7 और सामयिक अनुप्रयोगों13,14,43 दोनों के लिए साहित्य के भीतर अधिक आम है। हालांकि, यहां वर्णित गुरुत्वाकर्षण दृष्टिकोण (तापमान-विशिष्ट) घनत्व को शामिल करने के माध्यम से तापमान के विचार के कारण स्वाभाविक रूप से अधिक सटीक है, जिससे अधिक सटीक सूत्रीकरण तैयारी होती है।
नमूना नॉकडाउन:
नमूनों को नीचे गिराना इस विधि का एक महत्वपूर्ण घटक है और कीटनाशक और वजन माप के सटीक प्रशासन के लिए अनुमति देता है। हालांकि, जीवों को खटखटाने में अनिवार्य रूप से शारीरिक तनाव और क्षति का खतरा होता है, जैसा कि पहले दिखाया गया था30। इसलिए, यह सुनिश्चित करने के लिए नमूनों को खटखटाते समय सतर्क और सावधान रहें कि i) प्रत्येक नमूने को एक समान अवधि के लिए खटखटाया जाता है, ii) नॉकडाउन की लंबाई को न्यूनतम रखा जाता है, और iii) नॉकडाउन की विधि को सभी नमूनों में सुसंगत रखा जाता है। इसके अतिरिक्त, कीटनाशक आवेदन से पहले नॉकडाउन विधि का अलग से परीक्षण करने की सलाह दी जाती है, यह सुनिश्चित करने के लिए कि विधि सफल है और 10% से अधिक नियंत्रण मृत्यु दर को प्रेरित नहीं करती है। प्रारंभिक परीक्षण में अनुभवहीन उपयोगकर्ता के लिए अधिक समय लग सकता है, जिससे लंबे समय तक नॉकडाउन समय हो सकता है। इसलिए, पहले assays से परिणामों की व्याख्या करते समय सावधान रहें।
मृत्यु दर का आकलन:
मृत्यु दर का आकलन करना चुनौतीपूर्ण हो सकता है, खासकर जब कीटनाशक पूरी तरह से नहीं मारता है, लेकिन केवल मच्छर या मक्खी को नीचे गिराता है या मारता है। इसलिए, इस बात से अवगत होना महत्वपूर्ण है कि कीटनाशक लक्ष्य जीव को कैसे प्रभावित करता है और शुरू करने से पहले “मृत” (या खटखटाया गया) जीवों के लिए एक स्पष्ट परिभाषा है। इसके अतिरिक्त, यह सिफारिश की जाती है कि एक ही व्यक्ति को भिन्नता को कम करने के लिए खुराक और प्रतिकृति के बीच मृत्यु दर का आकलन किया जाए।
प्रोटोकॉल संशोधन: नीचे वर्णित कई संशोधनों को इसकी बहुमुखी प्रतिभा और पहुंच में सुधार करने के लिए इस प्रोटोकॉल पर लागू किया जा सकता है।
छोटे या बड़े आकार के कीड़ों के लिए परख अनुकूलन:
छोटे या बड़े नमूनों का उपयोग करते समय, क्रमशः कीटनाशक की एक छोटी या बड़ी खुराक की मात्रा को लागू करने की सलाह दी जाती है। एक उदाहरण के रूप में, हमने 0.5 μL खुराक को 0.2 μL खुराक के लिए कम करके फल मक्खियों के लिए मच्छर प्रोटोकॉल को अनुकूलित किया। सुनिश्चित करें कि सही सिरिंज आकार चुना खुराक मात्रा के लिए चुना गया है।
क्षेत्र कीड़े के लिए परख अनुकूलन:
क्षेत्र कीटों का उपयोग करते समय, कीट के आकार में अधिक भिन्नता हो सकती है। इसलिए, छोटे समूहों (जैसे, प्रति कप) में कीड़ों का वजन एक बड़े समूह के बजाय अनुशंसित किया जाएगा (उदाहरण के लिए, एक प्रयोग के लिए उपयोग किए जाने वाले सभी कीड़े)। यह क्षेत्र कीट द्रव्यमान में अंतर के साथ जुड़े कीटनाशक संवेदनशीलता में संभावित भिन्नता को पकड़ने में मदद कर सकता है।
उपकरण संशोधन:
कीट हैंडलिंग तम्बू: नमूने की खुराक को एक कीट हैंडलिंग तम्बू के तहत पूरा किया जा सकता है जो बस पीवीसी पाइप और मच्छर जाल के साथ बनाया गया है। यह एक संलग्न कमरे (जैसे, कीट) का एक विकल्प हो सकता है और उन क्षेत्रों में संभावित कीटनाशक संदूषण को खत्म करने में मदद कर सकता है जहां कीट पालन हो सकता है। इस कीट हैंडलिंग तम्बू का निर्माण करना आसान है और कम लागत (~ $ 70)। वैकल्पिक रूप से, पिंजरे को संभालने वाला एक कीट खरीदा जा सकता है (~ $ 425)।
चिल टेबल: बर्फ पैक या बर्फ की ट्रे का उपयोग नमूने को खटखटाने और / या नमूने को गिराने के लिए किया जा सकता है।
इनक्यूबेटर: इनक्यूबेटर को नमूने को पालने और कीटनाशक उपचार के बाद 24 घंटे के लिए नमूने को पकड़ने के लिए अनुशंसित किया जाता है। यदि एक इनक्यूबेटर उपलब्ध नहीं है, तो इसका निर्माण किया जा सकता है। इनक्यूबेटर बनाने के लिए आवश्यक उपकरणों में एक अछूता कंटेनर, ह्यूमिडिफायर, गर्मी केबल, आर्द्रता और तापमान नियंत्रक, और एक प्रकाश शामिल है, जिसे ~ $ 170 की कुल लागत तक जोड़ना चाहिए, पिछले तरीकों के बाद और विस्तार करनाचाहिए।
कप पकड़ना: हालांकि प्लास्टिक के कप का उपयोग उपचारित नमूने को क्रमबद्ध करने और पकड़ने के लिए किया जाता है, मोम-पंक्तिबद्ध पेपर कप या कांच के कंटेनर उपयुक्त विकल्प होंगे।
जीव और जीवन चरण संशोधन:
यह विधि अन्य वैक्टर, कीड़े, और / या आर्थ्रोपोड्स जैसे कि क्यूलेक्स क्विंकफेसिएटस मच्छर32,घर मक्खियों 32, और तिलचट्टे45, साथ ही साथ गैर-वयस्क जीवन चरणों के साथ उपयोग के लिए बहुत अनुकूलहै, जैसे कि मच्छर लार्वा46।
सामयिक अनुप्रयोग स्थान संशोधन:
यह विधि मच्छरों के लिए वेंट्रल वक्ष और पेट क्षेत्र में कीटनाशक को लागू करने का वर्णन करती है (और फल मक्खियों के लिए डोरसम)। हालाँकि, अन्य अनुप्रयोग स्थानों का उपयोग तब तक किया जा सकता है जब तक कि एक्सपोज़र साइट सुसंगत न हो। स्थिरता महत्वपूर्ण है क्योंकि कीटनाशक संवेदनशीलता आवेदन स्थान32 के आधार पर भिन्न हो सकती है।
समस्या निवारण सलाह: इस विधि में कई चरण हैं जो शुरू में चुनौतीपूर्ण हैं। नीचे वर्णित सबसे आम मुद्दों में से कुछ हैं जो एक मुठभेड़ कर सकते हैं।
कीटनाशक समाधान ों का रिसाव/वाष्पीकरण:
कीटनाशकों को आमतौर पर एसीटोन में भंग कर दिया जाता है, जो एक अत्यधिक वाष्पशील यौगिक है। इसका मतलब है कि एसीटोन कमरे के तापमान पर जल्दी से वाष्पित हो जाता है, जिससे समय के साथ कीटनाशक सांद्रता बढ़ जाती है। यदि कीटनाशक समाधान लीक या वाष्पीकरण प्रतीत होते हैं, तो समाधानों को रीमेक करें, यह सुनिश्चित करें कि ट्यूब का ढक्कन कसकर चालू है, और डबल-चेक करें कि भंडारण प्रोटोकॉल का ठीक से पालन किया जा रहा है (उदाहरण के लिए, पैराफिल्म का उपयोग किया जा रहा है, और ट्यूबों को सीधे संग्रहीत किया जाता है)। यदि लीक जारी रहता है, तो विभिन्न तापमानों पर एसीटोन अनुभवों की मात्रा में परिवर्तन के लिए अधिक जगह की अनुमति देने के लिए ट्यूबों को कम मात्रा में भरने का प्रयास करें। इसके अतिरिक्त, यदि विलायक के रूप में एसीटोन का उपयोग कर रहे हैं, तो सुनिश्चित करें कि ट्यूबों को एसीटोन भंडारण (जैसे, एफईपी, टीएफई और पीएफए प्लास्टिक) के लिए रेट किया गया है। यदि हाइड्रोफोबिक कीटनाशकों का उपयोग कर रहे हैं, तो समाधानों को कांच की शीशियों में संग्रहीत करें (जैसा कि हाइड्रोफोबिक कीटनाशक प्लास्टिक से कम कांच का पालन करते हैं)। वाष्पीकरण की निगरानी करने के लिए भंडारण से पहले समाधान के मेनिस्कस को चिह्नित करना भी अच्छा अभ्यास है।
जीवों का वजन करते समय माइक्रोबैलेंस पर बहने वाला वजन:
यदि पैमाने पर वजन पढ़ना बह रहा है (धीरे-धीरे ऊपर या नीचे जा रहा है), तो यह स्थिर के कारण हो सकता है। बहाव अक्सर तब होता है जब प्लास्टिक की वस्तुओं में जीवों का वजन होता है, क्योंकि प्लास्टिक आसानी से एक स्थिर चार्ज पकड़ सकता है। इससे बचने के लिए, वजन वाले प्लास्टिक कंटेनर के नीचे एक वजन कागज रखा जा सकता है, या कांच जैसे गैर-प्लास्टिक कंटेनर का उपयोग किया जा सकता है।
असामान्य मृत्यु दर के परिणाम:
ऐसे कई तरीके हैं जिनके द्वारा मृत्यु दर के परिणाम असामान्य लग सकते हैं, जैसे नियंत्रण में उच्च मृत्यु दर या सभी कीटनाशक खुराकों में उच्च / कम मृत्यु दर का निरीक्षण करना। प्रत्येक परिदृश्य समस्या निवारण के लिए निम्न मामलों की समीक्षा करें।
उच्च नियंत्रण मृत्यु दर
यदि नियंत्रण समूह (10% या उससे अधिक) में उच्च मृत्यु दर है, तो नॉकडाउन विधि और नमूनों को खटखटाए जाने के समय की लंबाई का मूल्यांकन करें। यदि संभव हो, तो उस समय की लंबाई को कम करें जिसके लिए नमूनों को खटखटाया जाता है। नियंत्रण में उच्च मृत्यु दर पर विचार करने के लिए अन्य संभावित कारकों में शामिल हैं i) यह जांचना कि क्या इनक्यूबेटर सेटिंग्स सही हैं- असामान्य तापमान और / या आर्द्रता मृत्यु दर में वृद्धि हो सकती है। तापमान और आर्द्रता को एक स्वतंत्र डेटा लकड़हारा के साथ जांचा जाना चाहिए। ii) कीट हैंडलिंग का आकलन करना। कीड़ों को बहुत अधिक या बहुत मोटे तौर पर संभालने से उच्च मृत्यु दर हो सकती है। iii) यह जांचना कि क्या नियंत्रण समूह के इलाज के लिए उपयोग किए जाने वाले 100% एसीटोन में या इंस्ट्रूमेंटेशन पर कोई कीटनाशक संदूषण नहीं है। एसीटोन को बदलें और एसीटोन या इथेनॉल के साथ सभी उपकरणों को साफ करें। बार-बार दस्ताने को बदलकर, स्पिलेज को रोककर, और उपकरणों की सफाई करके संदूषण से बचें। ध्यान दें कि पूरक फ़ाइल 3 में, नियंत्रण (एसीटोन-केवल) कप के भीतर अधिकतम दो मच्छरों की मृत्यु हो गई। मृत्यु दर के इस स्तर को उच्च नहीं माना जाता है (यह 10% से कम है), और इसलिए, चिंता का कोई कारण नहीं था।
सभी उजागर समूहों में उच्च मृत्यु दर (लेकिन नियंत्रण समूहों में नहीं)
परीक्षण के लिए कम कीटनाशक सांद्रता या छोटी खुराक की मात्रा का उपयोग करें। उपयोग की जाने वाली खुराक न्यूनतम खुराक से ऊपर हो सकती है जो मृत्यु दर को प्रेरित नहीं करेगी। सही खुराक सीमा की पहचान करने के लिए कई 10-गुना dilutions का उपयोग करें, और संदूषण को बाहर निकालें। संदूषण से बचने के लिए, सबसे कम एकाग्रता के साथ खुराक शुरू करें और उच्चतम एकाग्रता की ओर काम करें। इसके अतिरिक्त, सुनिश्चित करें कि उपयोग किए जाने वाले सभी उपकरणों को नियमित रूप से एसीटोन और / या इथेनॉल के साथ साफ किया जाता है, नमूने पर लागू खुराक बहुत छोटी होती है, और यहां तक कि थोड़ा सा भी क्रॉस-संदूषण परिणामों को प्रभावित कर सकता है।
सभी उजागर समूहों में कम मृत्यु दर
उच्च कीटनाशक सांद्रता का उपयोग करें। उपयोग की जाने वाली खुराक सभी आबादी में मृत्यु दर का कारण बनने के लिए बहुत कम हो सकती हैं। सही खुराक सीमा की पहचान करने के लिए, नमूनों को कई और 10 गुना केंद्रित खुराक के लिए उजागर करें। सुनिश्चित करें कि कीटनाशक समाधान समाप्त या अवक्रमित नहीं हुए हैं (संभावित रूप से उच्च तापमान या प्रकाश जोखिम के कारण)। यदि समाधान समाप्त हो गए हैं या अपमानित होने का संदेह है, तो समाधानों को रीमेक करें और सुनिश्चित करें कि उचित भंडारण स्थितियों का पालन किया जाए।
प्रतिकृतियों/दिनों के बीच असंगत मृत्यु दर
दिन का वह समय जब कीड़े कीटनाशक के संपर्क में आते हैं, तो व्यक्त प्रतिरोध के स्तर को प्रभावित कर सकता है, विशेष रूप से चयापचय प्रतिरोध34 के लिए। मृत्यु दर में परिवर्तन में योगदान करने वाले संभावित चर के रूप में दिन के समय से बचने के लिए प्रत्येक दिन समय की एक ही खिड़की के दौरान इस प्रोटोकॉल को दोहराएं। प्रतिकृतियों के बीच असंगत मृत्यु दर में योगदान करने वाले अन्य संभावित कारकों में शामिल हैं i) नमूनों को प्रयोगों के बीच अलग-अलग पाला जा रहा है। सुनिश्चित करें कि सभी नमूने एक ही आयु सीमा के हैं, एक ही तापमान और समान घनत्व और भोजन की उपलब्धता पर पाले जाते हैं। ii) कीटनाशक सांद्रता समय के साथ अपमानजनक या एसीटोन वाष्पीकरण के कारण अधिक केंद्रित हो रही है। समाधान रीमेक और उचित भंडारण की स्थिति सुनिश्चित करें। iii) असंगत मृत्यु दर स्कोरिंग। सुनिश्चित करें कि एक ही व्यक्ति मृत्यु दर स्कोर करता है या टीम में लगातार उपयोग करने के लिए एक स्पष्ट प्रोटोकॉल विकसित करता है। मृत्यु दर स्कोरिंग में पूर्वाग्रह को कम करने के लिए अंधा स्कोरिंग का उपयोग करें।
सॉर्टिंग ट्रे की सतह से चिपके कीड़े:
एसीटोन इस प्रोटोकॉल में उपयोग किए जाने वाले प्लास्टिक पर प्रतिक्रिया करता है, जैसे कि पेट्री व्यंजन। नमूना संभवतः सतह का पालन करेगा यदि पेट्री व्यंजन या इसी तरह की प्लास्टिक की सतहों पर एसीटोन का उपयोग कर रहा है। इस आसंजन को वजन कागज के साथ छँटाई ट्रे को अस्तर करके या गैर-प्लास्टिक सॉर्टिंग ट्रे का उपयोग करके टाला जा सकता है। इसके अतिरिक्त, छँटाई ट्रे या कप धारण करने में प्लास्टिक की सतह पर संघनन से संघनन कीटों को संक्षेपण का पालन करने का कारण बन सकता है, या नमूना बहुत ठंडा हो सकता है और सतह पर संभावित रूप से फ्रीज हो सकता है। संक्षेपण को कम करने के लिए नॉकडाउन विधि को समायोजित करें, जबकि नमूनों को बहुत ठंडा / जमे हुए होने से रोकता है (उदाहरण के लिए, नमूनों और प्लास्टिक सॉर्टिंग ट्रे के बीच वजन वाले कागज को रखें)।
R विश्लेषण त्रुटियाँ:
एक बार मृत्यु दर डेटा एकत्र होने के बाद, विश्लेषण के दौरान विभिन्न प्रकार की जटिलताएं हो सकती हैं। एक R कोड डेटा फ़ाइल के लिए क्रियाओं को पूरा नहीं कर सकता है सबसे आम कारण यह है कि डेटा स्वरूप कोड से मेल नहीं खाता है (उदाहरण के लिए, स्तंभ शीर्षक और / या रिक्त कक्ष)। यदि अधिक गंभीर जटिलताएं उत्पन्न होती हैं, तो Rstudio35 में निर्मित R सहायता पृष्ठों को देखें।
उपर्युक्त-वर्णित सामयिक अनुप्रयोग विधि की सीमाएँ:
सामयिक अनुप्रयोग विधि के माध्यम से कीटनाशक अवशोषण प्राकृतिक जोखिम की नकल नहीं करता है:
प्राथमिक शरीर पर सामयिक अनुप्रयोग कीटनाशक अवशोषण का प्राकृतिक तरीका नहीं है। क्षेत्र में, कीड़े ज्यादातर अपने पैरों के माध्यम से कीटनाशकों को अवशोषित करते हैं, जो कि वे कीटनाशक-उपचारित सतह के संपर्क में होते हैं या छोटे एयरोसोलकणों के माध्यम से अपने पंखों पर 47,48 होते हैं, न कि वेंट्रल सतह पर तेजी से एक्सपोजर के। हालांकि, एक ज्ञात कीटनाशक खुराक का प्रत्यक्ष अनुप्रयोग कीटनाशकों के लिए एक फेनोटाइपिक प्रतिक्रिया को सटीक रूप से स्थापित करेगा, जो आनुवंशिक और विकासवादी अध्ययन या अंतरिक्ष या समय में कीटनाशक संवेदनशीलता की तुलना के लिए आवश्यक है। इसलिए, यह दृष्टिकोण तकनीकी प्रतिरोध के परीक्षण के लिए फायदेमंद है, लेकिन सीधे व्यावहारिक प्रतिरोध को मापने नहीं होगा (एक क्षेत्र सेटिंग15 में वास्तविक हस्तक्षेप उपकरण की प्रभावकारिता)। हालांकि, यह ध्यान रखना महत्वपूर्ण है कि वर्तमान मानक तरीके (उदाहरण के लिए, डब्ल्यूएचओ ट्यूब परीक्षण और सीडीसी बोतल बायोएसेस) भी क्षेत्र में एयरोसोल (यानी, फॉगिंग द्वारा) कीटनाशक एक्सपोजर को कैप्चर या नकल नहीं कर सकते हैं।
सामयिक आवेदन assays केवल संपर्क अवशोषण कीटनाशकों का आकलन कर सकते हैं:
यह विधि कीटनाशकों के लिए अभिप्रेत है जो कीटनाशक के संपर्क और अवशोषण के माध्यम से काम करते हैं और मौखिक कीटनाशकों के साथ उपयोग के लिए नहीं, जैसे कि बोरिक एसिड आमतौर पर आकर्षक विषाक्त चीनी चारा49 में उपयोग किया जाता है।
विधि का महत्व:
सामयिक अनुप्रयोग विधि घातक खुराक (एकाग्रता नहीं) की गणना करके और तकनीकी (व्यावहारिक नहीं) प्रतिरोध को मापने के द्वारा कीटनाशक बायोएसेस के लिए अच्छी तरह से स्थापित मानकों पर फैलतीहै। नीचे दिए गए फायदे और मौजूदा कीटनाशक संवेदनशीलता assays पर इस विधि के नुकसान हैं.
घातक खुराक गणना:
यह विधि कीटनाशक की घातक खुराक को निर्धारित करती है, बजाय घातक एकाग्रता के जो सीडीसी और डब्ल्यूएचओ बायोएसेस भेदभावपूर्ण खुराक11 को स्थापित करने के लिए उपयोग करते हैं। घातक खुराक अधिक सार्थक है क्योंकि यह कीटनाशक की एक मात्रा मात्रा है जो मृत्यु दर को प्राप्त करने के लिए जानी जाती है। इसके विपरीत, घातक एकाग्रता इस बात पर विचार नहीं करती है कि जीव वास्तव में कितना कीटनाशक प्राप्त करता है। घातक खुराक गणना का उपयोग करते समय, लिंग- या आकार-निर्भर संवेदनशीलता प्रोफाइल के बीच के अंतर को अधिक सटीक रूप से देखा और परिमाणित किया जा सकता है, जिससे यह माप और भी बहुमुखी हो जाता है।
तकनीकी प्रतिरोध:
यह विधि तकनीकी प्रतिरोध का आकलन करती है, जो मानकीकृत, नियंत्रित वातावरण के तहत मापा जाने वाला प्रतिरोध है। इस तरह के माप कीटनाशक प्रतिरोध के प्रसार की निगरानी और संभावित मार्करों के साथ फेनोटाइपिक प्रतिरोध को जोड़नेके लिए उपयुक्त हैं। सामयिक अनुप्रयोग bioassay के परिणामस्वरूप मृत्यु दर में कमी की भिन्नता के कारण, यह नए प्रतिरोध मार्करों की बेहतर पहचान के लिए अनुमति देता है। हालांकि, मच्छर के लिए कीटनाशकों के अप्राकृतिक जोखिम के कारण, यह परख एक विशिष्ट आबादी में एक विशिष्ट हस्तक्षेप की प्रभावकारिता के अनुमान के लिए उपयुक्त नहीं है। इस तरह के व्यावहारिक प्रतिरोध15 के माप के लिए अन्य assays की आवश्यकता होती है।
नमूना अनुकूलन क्षमता:
इस विधि को अन्य महत्वपूर्ण आर्थ्रोपोड्स जैसे फसल कीटों (जैसे, कोलोराडो आलू बीटल), घर के कीटों (जैसे, कॉकरोच और बिस्तर कीड़े), या परागणकर्ताओं (जैसे, मधुमक्खियों) पर नॉकडाउन दृष्टिकोण और / या कीटनाशक खुराक, मात्रा, और / या एकाग्रता (जैसा कि ऊपर वर्णित है) में सरल परिवर्तन के साथ अभ्यास किया जा सकता है। अनुकूलन क्षमता की आसानी विभिन्न अनुसंधान क्षेत्रों में कीटनाशक प्रतिरोध अनुसंधान को एनालॉग करने में मदद कर सकती है। एक घातक एकाग्रता के बजाय एक एलडी 50 मूल्य का उपयोग जो50 % नमूनों को मारता है (एलसी50) प्रजातियों में सटीक तुलना की अनुमति देता है।
क़ीमत:
सीडीसी बोतल bioassays और डब्ल्यूएचओ ट्यूब परीक्षणों के समान, सामयिक आवेदन परख चलाने के लिए लागत न्यूनतम हैं ( सामग्री की तालिका देखें)। उपकरणों के आवश्यक टुकड़े सिरिंज (लगभग $ 70) और डिस्पेंसर (लगभग $ 100) हैं, जो assays में पुन: प्रयोज्य हैं।
आवश्यक नमूनों की संख्या:
20-25 नमूनों की एक न्यूनतम सामयिक आवेदन परख कप प्रति इस्तेमाल किया जाना चाहिए. कम से कम पांच कीटनाशक सांद्रता का प्रति प्रयोग परीक्षण करने की सिफारिश की जाती है, जिसमें प्रक्रिया के लिए अनुशंसित कम से कम तीन प्रतिकृतियां होती हैं। कुल मिलाकर, यह एक पूर्ण परीक्षण के लिए आवश्यक न्यूनतम 300-375 नमूनों में परिणाम देता है, जो डब्ल्यूएचओ ट्यूब परीक्षण या सीडीसी बोतल बायोएसेज़ का उपयोग करके प्रतिरोध तीव्रता परीक्षण करने के लिए आवश्यक नमूनों की संख्या के बराबर है। हालांकि, यदि कम परिवर्तनशीलता को सामयिक अनुप्रयोग बायोएसे के साथ प्राप्त किया जाता है, तो नमूनों की समान संख्या अंतरिक्ष या समय में संवेदनशीलता डेटा की तुलना करने के लिए अधिक सांख्यिकीय शक्ति का कारण बन सकती है।
The authors have nothing to disclose.
इस शोध को राष्ट्रीय विज्ञान फाउंडेशन द्वारा एसएच को पुरस्कार संख्या 2047572 के तहत एक कैरियर पुरस्कार द्वारा समर्थित किया गया था। हम फल मक्खी पालन और सामयिक आवेदन परख के लिए तैयारी में उनकी सहायता के लिए डेमियन रिवेरा को धन्यवाद देते हैं, विस्कॉन्सिन-मैडिसन विश्वविद्यालय में डॉ. गनेट्स्की अपने कैंटन-एस फल मक्खी तनाव को साझा करने के लिए, रॉकफेलर तनाव को साझा करने के लिए रोग नियंत्रण और रोकथाम केंद्र, और आईआईसीसी आइसोलाइन तनाव को साझा करने के लिए चिकित्सा कृषि और पशु चिकित्सा एंटोमोलॉजी के लिए संयुक्त राज्य अमेरिका के कृषि केंद्र। चित्रा 1 BioRender.com के साथ बनाया गया था।
1.5 mL microcentrifuge tubes | Thomas Scientific | 20A00L068 | Acetone aliquot storage |
1.5 mL screw cap tubes | Thomas Scientific | 1182K23 | Insecticide dilution storage |
15 mL conical tubes | VWR | 339651 | Insecticide dilution storage |
20 mL glass scintillation vials | Fisher Scientific | 0334125D | Fruit fly weighing |
25 μL syringe | Fisher Scientific | 14815288 | Topical applicator |
Acetone | Fisher Scientific | AC423240040 | ACS 99.6%, 4 L |
Aedes aegypti (IICC strain) | USDA CMAVE | NA | Insecticide resistant |
Aedes aegypti (Rockefeller strain) | CDC | NA | Insecticide susceptible |
Analytical scale | Fisher Scientific | 14-557-409 | Precision up to 0.1 mg |
Aspirator | Amazon | 6.49986E+11 | Mosquito collection device |
Bench paper | VWR | 89126-794 | Place under workspace |
Cotton swabs | Amazon | B092S8JVQN | Use for sorting insects |
Cotton wool balls | Amazon | B0769MKZWT | Use for sucrose solution |
Dispenser | Fisher Scientific | 1482225 | Repeater pipettor |
Drosophila melanogaster (Canton-S strain) | University of Wisconsin-Madison | NA | Insecticide susceptible |
Fine-tipped paint brushes | Amazon | B07KT2X1BK | Use for sorting insects |
Fruit fly stock bottles | Fisher Scientific | AS355 | Use for rearing and sorting fruit flies |
Hand-held CO2 dispenser | Fisher Scientific | NC1710679 | Use for knocking down insects |
Holding cups | Amazon | B08DXG7V1S | Clear plastic |
Ice pack | Amazon | B08QDWMMW5 | Use for knocking down fruit flies |
Ice trays | Amazon | 9301085269 | Use for knocking down insects |
Insect forceps | Amazon | B07B4767WR | Insect forceps |
Insecticide | Sigma-Aldrich Inc | 45423-250MG | Deltamethrin |
Labeling stickers | Amazon | B07Q4X9GWX | 3/4" Color dot stickers |
Labeling tape | Amazon | B00X6A1GYK | White tape |
Netting | Amazon | B07F2PHHWV | Use for covering holding cups and insect handling tent |
Petri dishes | Fisher Scientific | FB0875712H371 | 100 mm x 15 mm |
PVC Pipe | Lowe’s | 23971 | Insect handling tent materials |
Rubber bands | Amazon | B00006IBRU | Use for securing mesh/net on cups |
Sucrose | Amazon | B01J78INO0 | Granulated White Sugar |
Weighing paper | VWR | 12578-165 | 4" x 4" |