Protokollen beskriver en SARS-CoV-2 diagnostisk metode, der bruger open source-automatisering til at udføre RT-qPCR molekylær test af spytprøver. Denne skalerbare tilgang kan anvendes til klinisk folkesundhedsovervågning samt til at øge kapaciteten i mindre universitetslaboratorier.
Fremkomsten af den nylige globale sundhedskrise sars-CoV-2 introducerede centrale udfordringer for epidemiologisk forskning og klinisk testning. Karakteriseret ved en høj transmissionshastighed og lav dødelighed nødvendiggjorde COVID-19-pandemien nøjagtig og effektiv diagnostisk test, især i lukkede befolkninger såsom boliguniversiteter. Den første tilgængelighed af nukleinsyretest, som nasopharyngeal vatpinde, var begrænset på grund af forsyningskædetrykket, hvilket også forsinkede rapporteringen af testresultater. Spytbaseret omvendt transkriptase kvantitativ polymerasekædereaktion (RT-qPCR) test har vist sig at være sammenlignelig i følsomhed og specificitet med andre testmetoder, og spytopsamling er mindre fysisk invasiv for deltagerne. Derfor udviklede vi et multiplex RT-qPCR diagnostisk assay til befolkningsovervågning af Clemson University og det omkringliggende samfund. Assayet anvendte open source væskehåndteringsrobotter og termocyklister i stedet for komplekse kliniske automatiseringssystemer for at optimere arbejdsgangen og systemfleksibiliteten. Automatisering af spytbaseret RT-qPCR muliggør hurtig og nøjagtig detektion af en lang række virale RNA-koncentrationer til både store og små testkrav. Den gennemsnitlige turnaround for det automatiserede system var < 9 timer for 95% af prøverne og < 24 timer for 99% af prøverne. Omkostningerne ved en enkelt test var $ 2,80, da alle reagenser blev købt i bulkmængder.
Alvorlig akut respiratorisk syndrom-associeret coronavirus-2 (SARS-CoV-2), en ny coronavirus, opstod i slutningen af 2019 og spredte sig hurtigt i hele den globale befolkning1. SARS-CoV-2-infektionen forårsager coronavirus sygdom 2019 (COVID-19), en meget smitsom sygdom med potentielt alvorlige respiratoriske og inflammatoriske symptomer. Høj overførbarhed kombineret med lav dødelighed indikerede, at virusset ville sprede sig hurtigt gennem populationer og ville kræve øget diagnostisk testning2,3. Folkesundhedsanbefalinger tilskyndede til omfattende befolkningsscreening for at isolere tilfælde og efterfølgende reducere transmissionshastighederne4,5,6. Desuden viste modeller for befolkningsovervågning, at øget testfrekvens og faldende rapporteringstid havde en større effekt på at reducere transmissionen end at øge testfølsomheden7. Dette skyldes sandsynligvis, at inficerede personer kunne blive sat i karantæne tidligere og derved bryde smittekæder.
Den oprindelige nukleinsyreamplifikationstest (NAAT) standard var nasopharyngeal (NP) vatpinde behandlet af RT-qPCR8. Der opstår imidlertid komplikationer med denne form for testning for meget store populationer, såsom øgede relative omkostninger og forværret pres i forsyningskæden9,10. Desuden er både prøveindsamling og behandling af almindelige NAAT-metoder (herunder NP-vatpinde, orofaryngeale vatpinde, mid-turbinatpinde og næsepinde) afhængige af specialudstyr, reagenser og medicinsk personale9,10.
En passende erstatning for NP-vatpind RT-qPCR-test er spytbaseret test, som er et nøjagtigt diagnostisk værktøj til SARS-CoV-2-detektion11,12,13,14. Direkte udførelse af RT-qPCR på spytprøver giver samme følsomhed og specificitet som NP-vatpinde15. En stor fordel, som spyttest har i forhold til NP-vatpindstest, er, at det giver mulighed for selvindsamling af prøver16. Dette minimerer behovet for medicinsk personale og maksimerer let prøveindsamling for patienter ved at være mindre invasiv end NP-vatpinde. Da spytprøver ikke kræver buffere for at fjerne prøven fra en vatpind (som i tilfældet med NP-prøver), kan spytbaserede tests desuden anvende varmebaseret ribonukleinsyre (RNA) ekstraktion direkte, hvilket reducerer testomkostningerne ved at fjerne behovet for yderligere buffere, transportmedier og / eller RNA-ekstraktionsreagenser14,17.
Clemson University Research and Education in Disease Diagnostics and Intervention (REDDI) Lab blev oprettet for at imødekomme universitetets behov for COVID-19-test og overvågning. I lukkede befolkninger, herunder universiteter, gav hyppige overvågningstest kombineret med social afstand de mest gunstige resultater i epidemiologiske modeller for sygdomsprævalens18. De konsoliderede CDC 2019-nCOV RT-qPCR19- og SalivaDirect14-protokoller blev tilpasset, og automatisering blev brugt i den kliniske arbejdsgang til at reducere omkostningerne og forbedre leveringstiden. Tidligere grupper havde brugt open source væskehåndteringsrobotter til SARS-CoV-2 RNA-ekstraktionstrin20,21, men vi maksimerede brugen af robotterne til at forberede testplader og belastningsprøver22. Her viser vi, at den tilpassede protokol og brugen af open source væskehåndteringssystemer (figur 1) giver mulighed for hurtig og præcis spytbaseret RT-qPCR og er en effektiv strategi for storstilet folkesundhedsovervågning.
Det assay, der er beskrevet i protokollen, blev vurderet ved en uafhængig valideringsundersøgelse. Det blev konstateret, at assayet havde 98,9% specificitet (1,1% falsk positiv) og 90,0% følsomhed (10,0% falsk negativ), når den blev evalueret mod parrede nasopharyngeale vatpinde taget på samme tid (n = 837; 817 negative, 20 positive). Det er vigtigt, at tre deltagere, der testede positivt med TigerSaliva og negativ med en nasopharyngeal vatpind, blev testet igen med vatpinde 48 timer senere og returnerede positive resultater, hvilket indikerer, at TigerSaliva muligvis kan opdage SARS-CoV-2-infektioner tidligere i sygdomsforløbet.
Vi simulerede positive spytprøver ved at spiking virusfri spyt (både varmebehandlet og ikke-varmebehandlet) med kendte koncentrationer af SARS-CoV-2 syntetisk RNA og udførte en 10 gange fortynding for at bestemme Ct-grænsen i spyt. N1-genet kunne ikke påvises under 10.000 genkopier (ca. Ct = 28) i simulerede positive prøver. Vi formoder, at dette skyldes RNase-nedbrydning eller andre forvirrende faktorer. Imidlertid er interaktionen mellem spyt RNases og nøgen syntetisk RNA sandsynligvis forskellig fra interaktionen med virale partikler, selv efter at de er blevet denatureret af varme. Positive spytprøver er blevet identificeret med Ct >30, og eksterne laboratorier opnåede SARS-CoV-2 genetiske sekvensdata fra disse prøver. Vi spekulerer i, at de virale proteiner giver beskyttelse mod RNA-nedbrydning i patientens spytprøver.
Det mest kritiske trin i protokollen er implementeringen af automatisering til master mix forberedelse og spyt prøve behandling (henholdsvis afsnit 4 og 7). Dette giver mulighed for overlappende opgaveprocesser, hvilket drastisk reducerer ekspeditionstiden. Et andet kritisk trin er klinisk resultatfortolkning (§§ 11 og 12). Etablering af mellemliggende resultatkategorier (Rerun og N1 Rerun) minimerede også forekomsten af ufattelige testresultater.
Vi påviste, at variationen mellem manuelle og automatiserede metoder til indlæsning af spytprøver er ubetydelig (figur 5A), og at automatisering kan forbedre reproducerbarheden af SARS-CoV-2-detektion (figur 5B). Automatisering bør foretrækkes for at lette testning, når kliniske laboratorier designes og udvides25. Laboratoriearbejdsgangen forbedres med implementeringen af robotautomatiserede opgaver26. Open source-funktioner i væskehåndteringsrobotterne giver mulighed for implementering af brugerdefineret scripting til protokoldesign. Dette gør væskehåndteringsrobotter til et billigt og meget modificerbart system sammenlignet med traditionelle kliniske automatiseringsmetoder. Det er også en ideel strategi til udførelse af meget gentagne laboratorieopgaver. Systemets høje tilpasningsevne betyder frihed til at ændre labware (f.eks. Opsamlingsrør, pipettespidser eller plader med 384 brønde) i tilfælde af mangel. Derfor er automatisering ved hjælp af væskehåndteringsrobotter levedygtig til både overvågning og forskning i stor og lille skala.
En stor fordel ved denne teststrategi er en meget kortere ekspeditionstid i forhold til andre kliniske laboratorier. Brugen af automatiserede væskehåndteringsrobotter spiller en nøglerolle i at reducere ekspeditionstiden, men samtidig brug af robotter og termocyklister er også medvirkende til at maksimere testeffektiviteten. En robot og termocyklist skal betjenes som et par, hvor begge maskiner bruges sammen til uafbrudt prøvebelastning og analyse af prøveresultat. Når en jævn strøm af tildelte prøver er etableret, kan alle maskinpar betjenes samtidigt. Konstant samtidig brug af robotter og termocyklister øger testkapaciteten og effektiviteten drastisk, hvilket er afgørende for at imødekomme den høje testvolumen.
I modsætning til andre etablerede SARS-CoV-2 RT-qPCR-protokoller inkluderede vi et touchdown-trin i termocyklistprotokollen for at forbedre udglødningen af sonden og primersættene til målgenerne27, hvilket reducerede risikoen for mislykket forstærkning. Resultaterne viste, at touchdown forbedrede påvisningen af positive prøver uden at risikere tab af specifik primerbinding (tabel 4). Vi fastslog, at en bred vifte af både SARS-CoV-2 RNA-kopier (figur 4A) og Hs_RPP30 DNA-kopier (figur 4B) kan detekteres samtidigt ved RT-qPCR-assay.
En begrænsning af væskehåndteringsrobotter er muligheden for krydskontaminering fra positive prøver under spytoverførsel. Spyt er en viskoelastisk væske28 og kan snøre sig på tværs af tilstødende brønde efter at være blevet dispenseret fra pipettespidsen. Desuden kan heterogeniteten af spyt29 forårsage ujævn fordeling af virale partikler i hele prøven. Dette øger muligheden for både falske positive og negative, hvilket nødvendiggør udpegning af N1 Rerun- og Rerun-prøver. Imidlertid forsvandt 14,1% af prøverne, der oprindeligt blev udpeget som N1 Rerun, som positive for SARS-CoV-2 og var mere end 30 gange mere tilbøjelige end Rerun-prøver til at løse som positive efter gentestning. Derfor gav differentiering af Rerun fra N1 Rerun (figur 3) mulighed for mere nøjagtig adskillelse af potentielt positive prøver, hvilket øgede følsomheden og specificiteten af vores diagnostiske assay. Andre resulterende parametre til diagnostisk spyttest gjorde ikke denne sondring12,14,24,30,31.
Spytprøver kan være vanskelige at pipette på grund af heterogenitet og viskositet32. Varmebehandling denaturerer proteiner i spytbiomatrixen tilstrækkeligt, reducerer viskositeten og eliminerer behovet for RNA-ekstraktionsreagenser9, som var knappe i de tidlige stadier af pandemien10. Udvidet varmebehandling inaktiverer også tilstedeværende vira33, hvilket giver mulighed for laboratoriebehandling ved lavere biosikkerhedsniveauer. Følgelig blev en varmebaseret RNA-ekstraktion (beskrevet i pkt. 5.4) implementeret for at reducere viskositeten gennem proteindenaturering (figur 6). Baseret på resultaterne postulerer vi, at varmebehandling også kan homogenisere spytprøver ud over at denaturere proteinbiomatrixen. Andre grupper kombinerede varmebehandling og proteinase K-behandling for at øge homogeniteten9,14,34. Vi valgte ikke at implementere dette trin, da det kan denaturere virionproteiner med en hastighed, der efterlader viralt RNA udsat for varmenedbrydning35. Desuden kan prøvefortynding med proteinase K maskere positive prøver, der indeholder færre virale partikler, hvilket reducerer følsomheden. Derudover blev analyseresultaterne sammenlignet med et kommercielt tilgængeligt spytbaseret SARS-CoV-2-assay (Logix Smart COVID-19), der bruger magnetisk perle-RNA-ekstraktion (tabel 5). Det blev konstateret, at det nuværende assay var bedre egnet til at påvise svage positive prøver sammenlignet med det kommercielt tilgængelige assay.
Det er vanskeligt at kvantificere viruskopinummer i spyt ved kun at bruge RT-qPCR, fordi qPCR er semikvantitært. Der er iboende variation mellem Ct-værdier, der stammer fra tekniske begrænsninger. Genkopinummer kan bestemmes ud fra Ct-værdier (figur 4) og svarer nogenlunde til viralt kopinummer. En mulig løsning til at bestemme det virale kopinummer i spytprøver er ddPCR, som giver hård kvantificering af genkopier i reaktionen. Vi mener dog, at det er tilstrækkeligt at levere kvalitative resultater til klinikere, og relativt viralt indhold kan sammenlignes på tværs af prøver, der behandles med vores metoder.
På trods af nogle begrænsninger, der opstår ved brug af spyt, viser SARS-CoV-2-assayet ved spytbaseret RT-qPCR sig at være en effektiv metode til hurtig og pålidelig viral RNA-detektion på enhver testskala. Dette gælder især, når det kombineres med brugen af open source væskehåndteringssystemer. Denne testmetode kan ændres for at detektere andre nukleinsyresekvenser, der er relevante for diagnostik, såsom infektionssygdomsmidler, sygdomsmarkører eller andre vira. Dette gør analysen anvendelig til både klinisk og forskningsdiagnostisk indsats.
The authors have nothing to disclose.
Forfatterne takker Clemsons administration, medicinsk personale og kliniske laboratoriemedarbejdere på REDDI Lab, der hjalp med at implementere og styre SARS-CoV-2-test. Vi takker Dr. Phillip Buckhaults og Dr. Carolyn Bannister fra University of South Carolina for indledende projektrådgivning og branchekontakter til indkøb af udstyr. Vi takker mange studerende, professorer og medarbejdere for deres hjælp til prøveindsamling. Tak til Creative Inquiry-studerende for standard indsamling af kurvedata. Finansiering til denne undersøgelse blev modtaget fra National Institutes of Health-tilskuddet P20GM121342 (tildelt DD og LGP), Clemson Athletic Department, Clemson University’s Vice President for Research og South Carolina Governor & Joint Bond Review Committee.
100% EtOH | Fisher scientific | 22-032-601 | |
20 uL Filtered Pipette Tips | Opentrons | 20uL tips | |
2mL Microcentrifuge Tubes | Fisher Scientific | 14-666-313 | Alternate product may be used |
Armadillo PCR Plate, 384-well, clear, white wells | Thermo Scientific | AB3384 | Alternate product may be used |
Celltreat 2mL 96 Deep Well Plates | Fisher Scientific | 50-828-743 | For mastermix preparation |
Clear PCR Sealing Sheets | Thermo Scientific | AB0558 | Alternate product may be used |
DPEC Treated Water | Ambion (Thermo Scientific) | AM9916 | |
Flip Cap 50 mL Conical Tubes | VWR | 75845-210 | For sample collection |
Foil PCR Sealing Sheets | Thermo Scientific | AB0626 | For storage of mastermix plates, Alternate product may be used |
HS_RPP30 Synthetic DNA | Integrated DNA Technologies | 299788131 | P1 positive control |
Luna Buffer Probe One-Step Reaction | New England Biolabs | M3006B | |
Luna WarmStart RT Enzyme Mix | New England Biolabs | M3002B | |
nCOV_N1 Forward Primer, 100 nmol | Integrated DNA Technologies | 10006830 | |
nCOV_N1 Probe Aliquot, 50 nmol | Integrated DNA Technologies | 10006832 | Probe can be synthesized by other vendors with SYBR or FAM fluophores |
nCOV_N1 Reverse Primer, 100 nmol | Integrated DNA Technologies | 10006831 | |
Opentron HEPA Filter Module | Opentrons | N/A | Not required, but useful to reduce contamination |
Opentron Multichannel Attachment, P20 | Opentrons | 999-00005 | For mastermix preparation |
Opentron OT-2 Liquid Handling Robot | Opentrons | OT-2 | |
Opentron Pipette Attachment, P20 | Opentrons | 999-0000215 | For sample loading |
Oven | Memmert | UF450 PLUS 208V-3PH | |
PCR Tubes (rnase, dnase free) | Fisher Scientific | 14-230-225 | For aliquots of positive and neg controls |
PolarSafe Aluminum Cooling Block, 15-Well (1.5/2.0 mL Tubes) | VWR | 10808-952 | |
PolarSaf Aluminum Cooling Block, 24-Well (0.5mL tubes) | VWR | 10808-956 | |
RNAse P (ATTO 647) Probe, 50 nmol | Integrated DNA Technologies | 10007062 | Probe can be synthesized by other vendors with Cy5 fluorophore |
RNAse P Forward Primer, 100nmol | Integrated DNA Technologies | 10006836 | |
RNAse P Reverse Primer, 100 nmol | Integrated DNA Technologies | 10006837 | |
Sars-CoV-2 Synthetic RNA Control 2 | Twist Biosciences | 102024 / 103907 / 103909 | N1 Positive Control |
Scanners | Code | CR1500 | Only required when scaling up |
Small HEPA Filtered Hood | Erlab | Captair Bio 321 | For mastermix preparation |
Thermocycler CFX384 Touch | Biorad | CFX384 Touch | Alternate models can be used, e.g. CFX384 Opus |
X-acto Knife Set | Staples | N/A | To cut foil for keeping control wells covered |