Isolering af dyrkbare gær og skimmelsvampe fra jord for at undersøge svampepopulationsstruktur
Summary
Denne protokol er en effektiv, hurtig metode til dyrkning af gær og formen Aspergillus fumigatus fra store sæt jordprøver på så lidt som 7 dage. Metoderne kan let ændres for at imødekomme en række inkubationsmedier og temperaturer efter behov for eksperimenter.
Abstract
Jord er vært for en utrolig mængde mikrobielt liv, hvor hvert gram indeholder op til milliarder af bakterie-, arkæale og svampeceller. Flercellede svampe såsom skimmelsvampe og encellede svampe, bredt defineret som gær, opfylder væsentlige roller i jordøkosystemer som nedbrydere af organisk materiale og som fødekilder for andre jordboere. Svampeartsdiversitet i jorden er afhængig af en lang række klimatiske faktorer såsom nedbør og temperatur samt jordegenskaber, herunder organisk materiale, pH og fugt. Mangel på tilstrækkelig miljøprøvetagning, især i regioner i Asien, Afrika, Sydamerika og Mellemamerika, hindrer karakteriseringen af jordsvampesamfund og opdagelsen af nye arter.
Vi karakteriserede jordsvampesamfund i ni lande på tværs af seks kontinenter ved hjælp af ~ 4.000 jordprøver og en protokol udviklet i laboratoriet til isolering af gær og skimmelsvampe. Denne protokol begynder med separat selektiv berigelse for gær og den medicinsk relevante skimmel Aspergillus fumigatus, i flydende medier, samtidig med at bakterievækst hæmmes. Resulterende kolonier overføres derefter til faste medier og behandles yderligere for at opnå rene kulturer efterfulgt af nedstrøms genetisk karakterisering. Gærartsidentitet etableres via sekventering af deres interne transskriberede spacer (ITS) region af den nukleare ribosomale RNA-genklynge, mens den globale populationsstruktur af A. fumigatus udforskes via mikrosatellitmarkøranalyse.
Protokollen blev med succes anvendt til at isolere og karakterisere jordgær og A. fumigatus populationer i Cameroun, Canada, Kina, Costa Rica, Island, Peru, New Zealand og Saudi-Arabien. Disse resultater afslørede tiltrængt indsigt i globale mønstre i jordgærdiversitet samt global befolkningsstruktur og svampedræbende resistensprofiler af A. fumigatus. Dette papir præsenterer metoden til isolering af både gær og A. fumigatus fra internationale jordprøver.
Introduction
Svampe i jordens økosystemer spiller væsentlige roller i nedbrydning af organisk materiale, næringsstofkredsløb og jordgødning1. Både kulturuafhængige (dvs. high-throughput sekventering) og kulturafhængige tilgange anvendes i vid udstrækning i studiet af jordsvampe 2,3. Mens den store mængde data, der genereres af metabarkodesekventering med høj kapacitet, er nyttig til at belyse brede mønstre i samfundsstruktur og mangfoldighed, kan den kulturafhængige tilgang give meget komplementær information om svampesamfundenes taksonomiske og funktionelle strukturer samt mere specifikke profiler af individuelle organismer gennem nedstrøms mangfoldighed og funktionelle analyser på grund af tilgængeligheden af rene svampekulturer.
På trods af at gær, der sjældent overstiger tusindvis af celler pr. Gram jord, er gær, bredt defineret som encellede svampe, essentielle nedbrydere og fødekilder for andre jordboere 4,5. Faktisk kan gær være de dominerende jordsvampe i kolde biosfærer som kontinental Antarktis 6,7. Jord er også et primært reservoir af medicinsk relevante gær, der forårsager alvorlige opportunistiske infektioner hos mennesker og andre pattedyr8. På trods af morfologiske ligheder er gærarter fylogenetisk forskellige og forekommer blandt filamentøse svampe i to store phyla, Ascomycota og Basidiomycota, inden for svamperiget9. Gær mangler en definerende DNA-signatur ved svampebarkodningsgenet, den interne transskriberede afstandsstykke (ITS) region i den nukleare ribosomale RNA-genklynge10, hvilket gør dem umulige at skelne fra andre svampe i metagenomics-undersøgelser og dermed nødvendiggør brug af kulturafhængige metoder til at isolere gærarter.
Protokollen nedenfor blev implementeret for at karakterisere jordgærsamfund i ni lande og identificere globale tendenser og mønstre i jordgærdiversitet 9,11,12. Metagenomics-tilgange er af begrænset anvendelse ved undersøgelse af målgrupper af organismer såsom gær 2,3. På grund af deres fylogenetiske mangfoldighed kan gær ikke skelnes fra andre svampe baseret på DNA-sekvens alene. Undersøgelse af gærpopulationer kræver således fortsat brug af kulturafhængig isolation. Dyrkning er dog ofte betydeligt mere tidskrævende og kræver mere personale til at udføre forsøgene. Derfor er protokollen optimeret og strømlinet til hurtigere behandling med begrænset personale. Den største fordel ved dyrkning er, at de identificerede gærarter er levende gær og ikke døde, og dermed er mere tilbøjelige til at være ægte jordboere snarere end forbigående celler, der er til stede i jorden. Det er blevet anslået, at ca. 40% af svampe-DNA i jord enten er forurenende stoffer fra andre miljøer, ekstracellulære eller kommer fra celler, der ikke længere er intakte, hvilket forårsager sekventeringsmetoder med høj kapacitet til at overvurdere svamperigdom med så meget som 55% 13. Kulturafhængig isolering kan let bekræfte gærarters identitet med den ekstra fordel at sikre ren kultur, der skal bruges i downstream-analyser. Faktisk blev rene kulturer af 44 formodede nye gærarter identificeret ved hjælp af denne jordisoleringsprotokol, der tillod brugen af en række metoder til at studere deres taksonomiske og funktionelle egenskaber i detaljer14.
Protokollen nedenfor kan også bruges til at isolere skimmelsvampe, der findes i jord, såsom A. fumigatus. Aspergillus fumigatus er en termofil og saprofytisk skimmelsvamp med en bred, global fordeling i jord15. Det er blevet isoleret fra adskillige kliniske og ikke-kliniske miljøer. Ikke-klinisk prøveudtagning omfatter almindeligvis luft, organisk affald (kompost, savstøv, tulipanløgaffald) og jord (landbrugs-, have- og naturlig jord)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus er et humant opportunistisk patogen, der forårsager en række infektioner, der samlet betegnes aspergillose, der påvirker over 8 millioner mennesker over hele verden16,20. Cirka 300.000 mennesker over hele kloden lider af invasiv aspergillose, som er den mest alvorlige form for aspergillose16. Afhængigt af faktorer som patientpopulationen, infektionsstedet og effekten af svampedræbende terapi kan dødeligheden være så høj som 90%. I løbet af de sidste årtier er resistens over for svampedræbende terapier steget, hvilket kræver global overvågningsindsats i både kliniske og miljømæssige populationer for at spore disse resistensgenotyper 21,22,23. På grund af sin evne til at vokse ved temperaturer op til 50 ° C kan denne temperatur udnyttes til at vælge A. fumigatus-isolater fra jord ved hjælp af kulturafhængige metoder. Aspergillus fumigatus-isolater genotypes almindeligvis ved ni stærkt polymorfe korte tandem-gentagelseslokaliteter (STR), der har vist sig at have høj diskriminerende effekt mellem stammer24. Disse STR-genotyper kan sammenlignes med andre tidligere undersøgte populationer for at spore spredningen af A. fumigatus-genotyper, herunder lægemiddelresistensgener, rundt om i verden.
Nedenfor beskriver vi en protokol for hurtig isolering af gær og A. fumigatus fra jordprøver på en kulturafhængig måde. Afhængigt af mængden af jord, der opnås pr. prøve, kan jordprøverne deles mellem de to protokoller. I sammenligning med lignende metoder, der isolerer gær og A. fumigatus fra jord, bruger denne protokol 10 gange mindre jord pr. Opnået isolat. Undersøgelser, der forsøger at isolere A. fumigatus fra jord, kræver mellem 1 og 2 g jord pr. isolat, mens denne protokol kun kræver 0,1-0,2 g jord 18,19,25. Denne protokol bruger mindre plast og beholdere, der letter dens design med høj kapacitet. Derfor kan et større antal prøver behandles ved hjælp af mindre plads til udstyr såsom inkubatorer og rulletromler. Jordprøver kan behandles fuldt ud for at opnå isolater på så lidt som 7 dage. Denne protokol er optimeret til at tillade behandling af op til 150-200 prøver pr. Dag pr. Person.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollen udviklet til isolering af gær og A. fumigatus fra jord er en hurtig og effektiv metode til jordbehandling med høj kapacitet og svampeisolering. Protokollen kræver kun en lille mængde jord (0,1-0,2 g) pr. prøve, hvilket gør det muligt at udtage prøver af flere steder med lignende indsats. Den hurtige behandlingstid sikrer, at resultaterne kan opnås inden for en kort tidsramme og giver tid til fejlfinding og gentagelse af eksperimenter, hvis det er nødvendigt. Denne protokol kan let replikeres…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denne forskning blev støttet af tilskud fra Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant No. ALLRP 570780-2021) og McMaster University.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt Inc | 72.690.001 | |
| Benomyl powder | Toronto Research Chemicals | B161380 | |
| Chloramphenicol powder | Sigma-Aldrich | SKU: C0378-5G | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | SKU: D9434-500G | |
| Fragment Analysis Software | NCBI's Osiris | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/ | |
| ITS sequence database | NCBI GenBank | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ | |
| ITS sequence database | UNITE | https://unite.ut.ee/ | |
| Peptone | Sigma-Aldrich | SKU: P5905-500G | |
| Reusable cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-12 | |
| Sterile 10 cm diameter Petri dishes | Sarstedt Inc | 83.3902 | |
| Sterile 13 mL culture tubes | Sarstedt Inc | 62.515.006 | |
| Wooden plain-tipped applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | SKU: Y1625-250G |
References
- Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., Jȩdryczka, M. Fungal biodiversity and their role in soil health. Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).
- Tedersoo, L., et al. Global diversity and geography of soil fungi. Science. 346 (6213), 1256688 (2014).
- Egidi, E., et al. A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
- Yurkov, A. M. Yeasts of the soil – obscure but precious. Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).
- Botha, A. The importance and ecology of yeasts in soil. Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).
- Connell, L., et al. Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica. Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).
- Vishniac, H. S. A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient. Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).
- Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. . The Yeasts: A Taxonomic Study. , (2011).
- Samarasinghe, H., et al. Global patterns in culturable soil yeast diversity. iScience. 24 (10), 103098 (2021).
- Xu, J. Fungal DNA barcoding. Genome. 59 (11), 913-932 (2016).
- Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils. FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).
- Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).
- Xu, J. Fungal species concepts in the genomics era. Genome. 63 (9), 459-468 (2020).
- Brakhage, A. A., Langfelder, K. Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus. Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
- Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).
- Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate. Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).
- Chowdhary, A., et al. Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India. PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen. PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).
- Sewell, T. R., et al. Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus. mBio. 10 (3), 00392 (2019).
- Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus. mSphere. 2 (1), 00019 (2017).
- Heo, S. T., et al. Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015. Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).
- de Valk, H. A., et al. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates. Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).
- Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes. Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).
- Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process. Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).
- Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. Isolation and characterization of mutations in the Β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 111 (4), 715-734 (1985).
- Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans. Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).
- Paoletti, M., et al. Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).
- De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).
- Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting linear mixed-effects models using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
- Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. BLAST ® Command Line Applications User Manual. National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).
- Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon. Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).
- Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils. Genes. 13 (1), 19 (2021).
- Snelders, E., et al. Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles. Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).
- Wang, H. -. C., et al. mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan. Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).
