Isolatie van kweekbare gisten en schimmels uit bodems om de structuur van schimmelpopulaties te onderzoeken
Summary
Dit protocol is een effectieve, snelle methode om gisten en de schimmel Aspergillus fumigatus uit grote sets bodemmonsters te kweken in slechts 7 dagen. De methoden kunnen eenvoudig worden aangepast om een reeks incubatiemedia en temperaturen te accommoderen als dat nodig is voor experimenten.
Abstract
De bodem is gastheer voor een ongelooflijke hoeveelheid microbieel leven, waarbij elke gram tot miljarden bacteriële, archaeale en schimmelcellen bevat. Meercellige schimmels zoals schimmels en eencellige schimmels, breed gedefinieerd als gisten, vervullen essentiële rollen in bodemecosystemen als afbrekers van organisch materiaal en als voedselbronnen voor andere bodembewoners. De diversiteit van schimmelsoorten in de bodem is afhankelijk van een groot aantal klimatologische factoren zoals regenval en temperatuur, evenals bodemeigenschappen zoals organisch materiaal, pH en vocht. Gebrek aan adequate milieubemonstering, vooral in regio’s van Azië, Afrika, Zuid-Amerika en Midden-Amerika, belemmert de karakterisering van bodemschimmelgemeenschappen en de ontdekking van nieuwe soorten.
We hebben bodemschimmelgemeenschappen in negen landen op zes continenten gekarakteriseerd met behulp van ~ 4.000 bodemmonsters en een protocol dat in het laboratorium is ontwikkeld voor de isolatie van gisten en schimmels. Dit protocol begint met afzonderlijke selectieve verrijking voor gisten en de medisch relevante schimmel Aspergillus fumigatus, in vloeibare media terwijl de bacteriegroei wordt geremd. Resulterende kolonies worden vervolgens overgebracht naar vaste media en verder verwerkt om zuivere culturen te verkrijgen, gevolgd door downstream genetische karakterisering. De identiteit van gistsoorten wordt vastgesteld via sequencing van hun interne getranscribeerde spacer (ITS) -regio van het nucleaire ribosomale RNA-gencluster, terwijl de wereldwijde populatiestructuur van A. fumigatus wordt onderzocht via microsatellietmarkeranalyse.
Het protocol werd met succes toegepast om bodemgist- en A. fumigatuspopulaties in Kameroen, Canada, China, Costa Rica, IJsland, Peru, Nieuw-Zeeland en Saoedi-Arabië te isoleren en te karakteriseren. Deze bevindingen onthulden de broodnodige inzichten in wereldwijde patronen in bodemgistdiversiteit, evenals de wereldwijde bevolkingsstructuur en antischimmelresistentieprofielen van A. fumigatus. Dit artikel presenteert de methode om zowel gisten als A. fumigatus te isoleren uit internationale bodemmonsters.
Introduction
Schimmels in bodemecosystemen spelen een essentiële rol bij de afbraak van organisch materiaal, nutriëntenkringloop en bodembemesting1. Zowel cultuuronafhankelijke (d.w.z. high-throughput sequencing) als cultuurafhankelijke benaderingen worden veel gebruikt bij de studie van bodemschimmels 2,3. Hoewel de grote hoeveelheid gegevens die wordt gegenereerd door metabarcode-sequencing met hoge doorvoer nuttig is voor het ophelderen van grootschalige patronen in gemeenschapsstructuur en diversiteit, kan de cultuurafhankelijke benadering zeer complementaire informatie bieden over de taxonomische en functionele structuren van schimmelgemeenschappen, evenals meer specifieke profielen van individuele organismen door middel van downstream diversiteit en functionele analyses vanwege de beschikbaarheid van pure schimmelculturen.
Ondanks het feit dat ze zelden duizenden cellen per gram grond overschrijden, zijn gisten, breed gedefinieerd als eencellige schimmels, essentiële afbrekers en voedselbronnen voor andere bodembewoners 4,5. In feite kunnen gisten de overheersende bodemschimmels zijn in koude biosferen zoals continentaal Antarctica 6,7. Bodem is ook een primair reservoir van medisch relevante gisten die ernstige opportunistische infecties veroorzaken bij mensen en andere zoogdieren8. Ondanks morfologische overeenkomsten zijn gistsoorten fylogenetisch divers en komen ze voor bij filamenteuze schimmels in twee belangrijke phyla, Ascomycota en Basidiomycota, binnen het schimmelrijk9. Gisten missen een bepalende DNA-signatuur bij het schimmelbarcoding-gen, het interne getranscribeerde spacer (ITS) -gebied van het nucleaire ribosomale RNA-gencluster10, waardoor ze niet te onderscheiden zijn van andere schimmels in metagenomics-onderzoeken en dus het gebruik van cultuurafhankelijke methoden vereisen om gistsoorten te isoleren.
Het onderstaande protocol werd geïmplementeerd om bodemgistgemeenschappen van negen landen te karakteriseren en wereldwijde trends en patronen in bodemgistdiversiteit te identificeren 9,11,12. Metagenomics-benaderingen zijn van beperkt nut bij het bestuderen van gerichte groepen organismen zoals gisten 2,3. Vanwege hun fylogenetische diversiteit kunnen gisten niet worden onderscheiden van andere schimmels op basis van dna-sequentie alleen. Het bestuderen van gistpopulaties vereist dus het voortdurende gebruik van cultuurafhankelijke isolatie. Het kweken is echter vaak aanzienlijk tijdrovender en vereist meer personeel om de experimenten uit te voeren. Daarom is het protocol geoptimaliseerd en gestroomlijnd voor een snellere verwerking met beperkt personeel. Het belangrijkste voordeel van kweken is dat de geïdentificeerde gistsoorten levende gisten zijn en geen dode, en dus eerder echte bodembewoners zijn dan voorbijgaande cellen die in de bodem aanwezig zijn. Er is geschat dat ongeveer 40% van het schimmel-DNA in de bodem ofwel verontreinigingen zijn uit andere omgevingen, extracellulair, of afkomstig zijn van cellen die niet langer intact zijn, waardoor high-throughput sequencing-benaderingen worden veroorzaakt om schimmelrijkdom met maar liefst 55% te overschatten 13. Cultuurafhankelijke isolatie kan de identiteit van gistsoorten gemakkelijk bevestigen met als bijkomend voordeel dat zuivere cultuur wordt veiliggesteld voor gebruik in downstream-analyses. Inderdaad, zuivere culturen van 44 vermeende nieuwe gistsoorten werden geïdentificeerd met behulp van dit bodemisolatieprotocol dat het gebruik van een reeks methoden mogelijk maakte om hun taxonomische en functionele eigenschappen in detail te bestuderen14.
Het onderstaande protocol kan ook worden gebruikt om schimmels in de bodem te isoleren, zoals A. fumigatus. Aspergillus fumigatus is een thermofiele en saprofytische schimmel met een brede, wereldwijde verspreiding in de bodem15. Het is geïsoleerd uit tal van klinische en niet-klinische omgevingen. Niet-klinische bemonstering omvat gewoonlijk lucht, organisch puin (compost, zaagsel, tulpenbollenafval) en grond (landbouw-, tuin- en natuurlijke bodems)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus is een menselijke opportunistische ziekteverwekker die een reeks infecties veroorzaakt die gezamenlijk aspergillose worden genoemd en die wereldwijd meer dan 8 miljoen mensen16,20 treffen. Ongeveer 300.000 mensen over de hele wereld lijden aan invasieve aspergillose, de meest ernstige vorm van aspergillose16. Afhankelijk van factoren zoals de patiëntenpopulatie, de plaats van infectie en de werkzaamheid van antischimmeltherapie, kan het sterftecijfer oplopen tot 90%. In de afgelopen decennia is de resistentie tegen antischimmeltherapieën toegenomen, waardoor wereldwijde surveillance-inspanningen in zowel klinische als omgevingspopulaties nodig zijn om deze resistentiegenotypes te volgen 21,22,23. Gezien het vermogen om te groeien bij temperaturen boven 50 °C, kan deze temperatuur worden gebruikt om te selecteren op A. fumigatus isolaten uit de bodem met behulp van cultuurafhankelijke methoden. Aspergillus fumigatusisolaten worden gewoonlijk gegenotypeerd bij negen zeer polymorfe korte tandem repeat (STR) loci, waarvan is aangetoond dat ze een hoog discriminerend vermogen hebben tussen stammen24. Deze STR-genotypen kunnen worden vergeleken met andere eerder onderzochte populaties om de verspreiding van A. fumigatus-genotypen, inclusief medicijnresistentiegenen, over de hele wereld te volgen.
Hieronder beschrijven we een protocol voor de snelle isolatie van gisten en A. fumigatus uit bodemmonsters op een cultuurafhankelijke manier. Afhankelijk van de hoeveelheid grond die per monster wordt verkregen, kunnen de bodemmonsters worden verdeeld tussen de twee protocollen. In vergelijking met vergelijkbare methoden die gist en A. fumigatus uit de bodem isoleren, gebruikt dit protocol 10x minder grond per verkregen isolaat. Studies die proberen A. fumigatus uit de bodem te isoleren, vereisen tussen 1 en 2 g grond per isolaat, terwijl dit protocol slechts 0,1-0,2 g grond 18,19,25 vereist. Dit protocol maakt gebruik van kleinere kunststoffen en containers die het ontwerp met hoge doorvoer vergemakkelijken. Daarom kan een groter aantal monsters worden verwerkt met minder ruimte voor apparatuur zoals incubators en roltrommels. Bodemmonsters kunnen volledig worden verwerkt om isolaten te verkrijgen in slechts 7 dagen. Dit protocol is geoptimaliseerd om verwerking van maximaal 150-200 monsters per dag per persoon mogelijk te maken.
Protocol
Representative Results
Discussion
Het protocol dat is ontwikkeld voor het isoleren van gisten en A. fumigatus uit de bodem is een snelle en efficiënte methode voor bodemverwerking met hoge doorvoer en schimmelisolatie. Het protocol vereist slechts een kleine hoeveelheid grond (0,1-0,2 g) per monster, waardoor meer locaties met vergelijkbare inspanning kunnen worden bemonsterd. De snelle doorlooptijd zorgt ervoor dat resultaten binnen een kort tijdsbestek kunnen worden verkregen en biedt tijd voor het oplossen van problemen en het indien nodig h…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit onderzoek werd ondersteund door subsidies van de Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant No. ALLRP 570780-2021) en McMaster University.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt Inc | 72.690.001 | |
| Benomyl powder | Toronto Research Chemicals | B161380 | |
| Chloramphenicol powder | Sigma-Aldrich | SKU: C0378-5G | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | SKU: D9434-500G | |
| Fragment Analysis Software | NCBI's Osiris | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/ | |
| ITS sequence database | NCBI GenBank | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ | |
| ITS sequence database | UNITE | https://unite.ut.ee/ | |
| Peptone | Sigma-Aldrich | SKU: P5905-500G | |
| Reusable cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-12 | |
| Sterile 10 cm diameter Petri dishes | Sarstedt Inc | 83.3902 | |
| Sterile 13 mL culture tubes | Sarstedt Inc | 62.515.006 | |
| Wooden plain-tipped applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | SKU: Y1625-250G |
References
- Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., Jȩdryczka, M. Fungal biodiversity and their role in soil health. Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).
- Tedersoo, L., et al. Global diversity and geography of soil fungi. Science. 346 (6213), 1256688 (2014).
- Egidi, E., et al. A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
- Yurkov, A. M. Yeasts of the soil – obscure but precious. Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).
- Botha, A. The importance and ecology of yeasts in soil. Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).
- Connell, L., et al. Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica. Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).
- Vishniac, H. S. A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient. Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).
- Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. . The Yeasts: A Taxonomic Study. , (2011).
- Samarasinghe, H., et al. Global patterns in culturable soil yeast diversity. iScience. 24 (10), 103098 (2021).
- Xu, J. Fungal DNA barcoding. Genome. 59 (11), 913-932 (2016).
- Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils. FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).
- Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).
- Xu, J. Fungal species concepts in the genomics era. Genome. 63 (9), 459-468 (2020).
- Brakhage, A. A., Langfelder, K. Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus. Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
- Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).
- Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate. Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).
- Chowdhary, A., et al. Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India. PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen. PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).
- Sewell, T. R., et al. Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus. mBio. 10 (3), 00392 (2019).
- Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus. mSphere. 2 (1), 00019 (2017).
- Heo, S. T., et al. Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015. Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).
- de Valk, H. A., et al. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates. Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).
- Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes. Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).
- Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process. Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).
- Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. Isolation and characterization of mutations in the Β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 111 (4), 715-734 (1985).
- Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans. Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).
- Paoletti, M., et al. Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).
- De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).
- Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting linear mixed-effects models using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
- Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. BLAST ® Command Line Applications User Manual. National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).
- Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon. Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).
- Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils. Genes. 13 (1), 19 (2021).
- Snelders, E., et al. Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles. Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).
- Wang, H. -. C., et al. mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan. Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).
