कवक जनसंख्या संरचना की जांच करने के लिए मिट्टी से कृषि योग्य खमीर और मोल्ड्स का अलगाव
Summary
यह प्रोटोकॉल खमीर और मोल्ड एस्परगिलस फ्यूमिगेटस को 7 दिनों में मिट्टी के नमूनों के बड़े सेट से संवर्धन करने का एक प्रभावी, त्वरित तरीका है। प्रयोगों के लिए आवश्यक इनक्यूबेशन मीडिया और तापमान की एक श्रृंखला को समायोजित करने के लिए विधियों को आसानी से संशोधित किया जा सकता है।
Abstract
मिट्टी माइक्रोबियल जीवन की एक अविश्वसनीय मात्रा की मेजबानी करती है, जिसमें प्रत्येक ग्राम में अरबों जीवाणु, पुरातन और कवक कोशिकाएं होती हैं। बहुकोशिकीय कवक जैसे मोल्ड और एककोशिकीय कवक, मोटे तौर पर खमीर के रूप में परिभाषित, मिट्टी के पारिस्थितिक तंत्र में कार्बनिक पदार्थों के डीकंपोजर के रूप में और अन्य मिट्टी निवासियों के लिए खाद्य स्रोतों के रूप में आवश्यक भूमिकाओं को पूरा करते हैं। मिट्टी में कवक प्रजातियों की विविधता वर्षा और तापमान जैसे जलवायु कारकों की एक भीड़ पर निर्भर करती है, साथ ही कार्बनिक पदार्थ, पीएच और नमी सहित मिट्टी के गुण भी। पर्याप्त पर्यावरणीय नमूने की कमी, विशेष रूप से एशिया, अफ्रीका, दक्षिण अमेरिका और मध्य अमेरिका के क्षेत्रों में, मिट्टी के कवक समुदायों के लक्षण वर्णन और उपन्यास प्रजातियों की खोज में बाधा डालती है।
हमने ~ 4,000 मिट्टी के नमूनों और खमीर और मोल्डों के अलगाव के लिए प्रयोगशाला में विकसित एक प्रोटोकॉल का उपयोग करके छह महाद्वीपों में नौ देशों में मिट्टी कवक समुदायों की विशेषता बताई। यह प्रोटोकॉल खमीर और चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक मोल्ड एस्परगिलस फ्यूमिगेटस के लिए अलग-अलग चयनात्मक संवर्धन के साथ शुरू होता है, तरल मीडिया में, जबकि जीवाणु विकास को रोकता है। परिणामस्वरूप कॉलोनियों को तब ठोस मीडिया में स्थानांतरित कर दिया जाता है और शुद्ध संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए आगे संसाधित किया जाता है, इसके बाद डाउनस्ट्रीम आनुवंशिक लक्षण वर्णन होता है। खमीर प्रजातियों की पहचान परमाणु राइबोसोमल आरएनए जीन क्लस्टर के अपने आंतरिक ट्रांसक्रिप्टेड स्पेसर (आईटीएस) क्षेत्र के अनुक्रमण के माध्यम से स्थापित की जाती है, जबकि ए फ्यूमिगेटस की वैश्विक जनसंख्या संरचना माइक्रोसैटेलाइट मार्कर विश्लेषण के माध्यम से खोजी जाती है।
प्रोटोकॉल को कैमरून, कनाडा, चीन, कोस्टा रिका, आइसलैंड, पेरू, न्यूजीलैंड और सऊदी अरब में मिट्टी खमीर और ए फ्यूमिगेटस आबादी को अलग करने और चिह्नित करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था। इन निष्कर्षों से मिट्टी खमीर विविधता में वैश्विक पैटर्न के साथ-साथ वैश्विक जनसंख्या संरचना और ए फ्यूमिगेटस के एंटिफंगल प्रतिरोध प्रोफाइल पर बहुत आवश्यक अंतर्दृष्टि का पता चला। यह पेपर अंतरराष्ट्रीय मिट्टी के नमूनों से खमीर और ए फ्यूमिगेटस दोनों को अलग करने की विधि प्रस्तुत करता है।
Introduction
मिट्टी के पारिस्थितिक तंत्र में कवक कार्बनिक पदार्थ अपघटन, पोषक तत्व साइकिल चालन और मिट्टी के निषेचन में आवश्यक भूमिका निभाते हैं1. दोनों संस्कृति-स्वतंत्र (यानी, उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण) और संस्कृति-निर्भर दृष्टिकोण व्यापक रूप से मिट्टी कवक 2,3 के अध्ययन में उपयोग किए जाते हैं। जबकि उच्च-थ्रूपुट मेटाबारकोड अनुक्रमण द्वारा उत्पन्न डेटा की बड़ी मात्रा सामुदायिक संरचना और विविधता में व्यापक पैमाने पर पैटर्न को स्पष्ट करने के लिए उपयोगी है, संस्कृति-निर्भर दृष्टिकोण कवक समुदायों के वर्गीकरण और कार्यात्मक संरचनाओं पर अत्यधिक पूरक जानकारी प्रदान कर सकता है, साथ ही शुद्ध कवक संस्कृतियों की उपलब्धता के कारण डाउनस्ट्रीम विविधता और कार्यात्मक विश्लेषण के माध्यम से व्यक्तिगत जीवों के अधिक विशिष्ट प्रोफाइल भी प्रदान कर सकता है।
मिट्टी के प्रति ग्राम शायद ही कभी हजारों कोशिकाओं से अधिक होने के बावजूद, खमीर, मोटे तौर पर एककोशिकीय कवक के रूप में परिभाषित किया गया है, अन्य मिट्टी निवासियों 4,5 के लिए आवश्यक डीकंपोजर और खाद्य स्रोत हैं। वास्तव में, खमीर महाद्वीपीय अंटार्कटिका 6,7 जैसे ठंडे जीवमंडलों में प्रमुख मिट्टी कवक हो सकता है। मिट्टी चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक खमीर का एक प्राथमिक भंडार भी है जो मनुष्यों और अन्य स्तनधारियों में गंभीर अवसरवादी संक्रमण का कारण बनतीहै 8. रूपात्मक समानता के बावजूद, खमीर प्रजातियां फाइटोलैनेटिक रूप से विविध हैं और कवक साम्राज्य 9 के भीतर दो प्रमुख फाइला, एस्कोमाइकोटा और बेसिडिओमाइकोटा में फिलामेंटस कवक के बीच होतीहैं। खमीर में फंगल बारकोडिंग जीन में एक परिभाषित डीएनए हस्ताक्षर की कमी होती है, परमाणु राइबोसोमल आरएनए जीन क्लस्टर10 के आंतरिक ट्रांसक्रिप्टेड स्पेसर (आईटीएस) क्षेत्र, उन्हें मेटाजेनोमिक्स जांच में अन्य कवक से अप्रभेद्य बनाते हैं और इस प्रकार खमीर प्रजातियों को अलग करने के लिए संस्कृति-निर्भर तरीकों के उपयोग की आवश्यकता होती है।
नीचे दिए गए प्रोटोकॉल को नौ देशों के मिट्टी खमीर समुदायों को चिह्नित करने और मिट्टी खमीर विविधता 9,11,12 में वैश्विक रुझानों और पैटर्न की पहचान करने के लिए लागू किया गया था। खमीर 2,3 जैसे जीवों के लक्षित समूहों का अध्ययन करते समय मेटाजेनोमिक्स दृष्टिकोण सीमित उपयोग के होते हैं। उनकी फाइटोलैनेटिक विविधता के कारण, खमीर को अकेले डीएनए अनुक्रम के आधार पर अन्य कवक से अलग नहीं किया जा सकता है। इस प्रकार, खमीर आबादी का अध्ययन करने के लिए संस्कृति-निर्भर अलगाव के निरंतर उपयोग की आवश्यकता होती है। हालांकि, संवर्धन अक्सर काफी अधिक समय लेने वाला होता है और प्रयोगों को करने के लिए अधिक कर्मियों की आवश्यकता होती है। इसलिए, प्रोटोकॉल को सीमित कर्मियों के साथ तेजी से प्रसंस्करण के लिए अनुकूलित और सुव्यवस्थित किया गया है। संवर्धन का मुख्य लाभ यह है कि पहचानी गई खमीर प्रजातियां जीवित खमीर हैं और मृत नहीं हैं, और इस प्रकार मिट्टी में मौजूद क्षणिक कोशिकाओं के बजाय सच्चे मिट्टी के निवासी होने की अधिक संभावना है। यह अनुमान लगाया गया है कि मिट्टी में लगभग 40% फंगल डीएनए या तो अन्य वातावरण, बाह्य कोशिकीय से दूषित होते हैं, या कोशिकाओं से आते हैं जो अब बरकरार नहीं हैं, जिससे उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण दृष्टिकोण फंगल समृद्धि को 55% 13 तक अधिक अनुमानित करते हैं। संस्कृति पर निर्भर अलगाव आसानी से डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले शुद्ध संस्कृति को सुरक्षित करने के अतिरिक्त लाभ के साथ खमीर प्रजातियों की पहचान की पुष्टि कर सकता है। दरअसल, इस मिट्टी अलगाव प्रोटोकॉल का उपयोग करके 44 नई खमीर प्रजातियों की शुद्ध संस्कृतियों की पहचान की गई थी जिसने विस्तार से अपने वर्गीकरण और कार्यात्मक गुणों का अध्ययन करने के लिए कई तरीकों के उपयोग की अनुमति दीथी।
नीचे दिए गए प्रोटोकॉल का उपयोग मिट्टी के भीतर मौजूद सांचों को अलग करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि ए। एस्परगिलस फ्यूमिगेटस मिट्टी15 में एक विस्तृत, वैश्विक वितरण के साथ एक थर्मोफिलिक और सैप्रोफाइटिक मोल्ड है। इसे कई नैदानिक और गैर-नैदानिक वातावरण से अलग किया गया है। गैर-नैदानिक नमूने में आमतौर पर हवा, कार्बनिक मलबे (खाद, देखा धूल, ट्यूलिप बल्ब अपशिष्ट), और मिट्टी (कृषि, उद्यान और प्राकृतिक मिट्टी) 16,17,18,19 शामिल हैं। एस्परगिलस फ्यूमिगेटस एक मानव अवसरवादी रोगज़नक़ है जो सामूहिक रूप से एस्परगिलोसिस नामक संक्रमण की एक श्रृंखला का कारण बनता है, जो दुनिया भर में16,20 में 8 मिलियन से अधिक लोगों को प्रभावित करता है। दुनिया भर में लगभग 300,000 लोग आक्रामक एस्परगिलोसिस से पीड़ित हैं, जो एस्परगिलोसिस16 का सबसे गंभीर रूप है। रोगी आबादी, संक्रमण की साइट और एंटिफंगल थेरेपी की प्रभावकारिता जैसे कारकों के आधार पर, मृत्यु दर 90% जितनी अधिक हो सकती है। पिछले कई दशकों में, एंटिफंगल उपचारों के प्रतिरोध में वृद्धि हुई है, इन प्रतिरोध जीनोटाइप21,22,23 को ट्रैक करने के लिए नैदानिक और पर्यावरणीय आबादी दोनों में वैश्विक निगरानी प्रयासों की आवश्यकता है। 50 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के तापमान पर बढ़ने की क्षमता को देखते हुए, इस तापमान का उपयोग संस्कृति-निर्भर तरीकों का उपयोग करके मिट्टी से ए फ्यूमिगेटस आइसोलेट्स के लिए चयन करने के लिए शोषण किया जा सकता है। एस्परगिलस फ्यूमिगेटस आइसोलेट्स को आमतौर पर नौ अत्यधिक बहुरूपी लघु अग्रानुक्रम दोहराव (एसटीआर) लोकी पर जीनोटाइप किया जाता है, जो उपभेदों24 के बीच उच्च भेदभावपूर्ण शक्ति दिखाया जाता है। इन एसटीआर जीनोटाइप की तुलना दुनिया भर में दवा प्रतिरोध जीन सहित ए फ्यूमिगेटस जीनोटाइप के प्रसार को ट्रैक करने के लिए अन्य पहले सर्वेक्षण की गई आबादी से की जा सकती है।
नीचे हम एक संस्कृति-निर्भर तरीके से मिट्टी के नमूनों से खमीर और ए फ्यूमिगेटस के त्वरित अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। प्रति नमूना प्राप्त मिट्टी की मात्रा के आधार पर, मिट्टी के नमूने दो प्रोटोकॉल के बीच साझा किए जा सकते हैं। मिट्टी से खमीर और ए फ्यूमिगेटस को अलग करने वाले समान तरीकों की तुलना में, यह प्रोटोकॉल प्राप्त प्रति अलग 10x कम मिट्टी का उपयोग करता है। मिट्टी से ए फ्यूमिगेटस को अलग करने का प्रयास करने वाले अध्ययनों के लिए प्रति पृथक 1 से 2 ग्राम मिट्टी की आवश्यकता होती है, जबकि इस प्रोटोकॉल के लिए केवल 0.1-0.2 ग्राम मिट्टी 18,19,25 की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल छोटे प्लास्टिक और कंटेनरों का उपयोग करता है जो इसके उच्च-थ्रूपुट डिजाइन की सुविधा प्रदान करते हैं। इसलिए, इनक्यूबेटर और रोलर ड्रम जैसे उपकरणों के लिए कम जगह का उपयोग करके बड़ी संख्या में नमूनों को संसाधित किया जा सकता है। मिट्टी के नमूनों को 7 दिनों में आइसोलेट्स प्राप्त करने के लिए पूरी तरह से संसाधित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को प्रति व्यक्ति प्रति दिन 150-200 नमूनों के प्रसंस्करण की अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मिट्टी से खमीर और ए फ्यूमिगेटस को अलग करने के लिए विकसित प्रोटोकॉल उच्च थ्रूपुट मिट्टी प्रसंस्करण और फंगल अलगाव के लिए एक तेज़ और कुशल तरीका है। प्रोटोकॉल केवल प्रति नमूना मिट्टी (0.1-0.2 ग्राम) की एक छो…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
इस शोध को कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (अनुदान सं। एएलएलआरपी 570780-2021) और मैकमास्टर विश्वविद्यालय।
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt Inc | 72.690.001 | |
| Benomyl powder | Toronto Research Chemicals | B161380 | |
| Chloramphenicol powder | Sigma-Aldrich | SKU: C0378-5G | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | SKU: D9434-500G | |
| Fragment Analysis Software | NCBI's Osiris | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/ | |
| ITS sequence database | NCBI GenBank | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ | |
| ITS sequence database | UNITE | https://unite.ut.ee/ | |
| Peptone | Sigma-Aldrich | SKU: P5905-500G | |
| Reusable cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-12 | |
| Sterile 10 cm diameter Petri dishes | Sarstedt Inc | 83.3902 | |
| Sterile 13 mL culture tubes | Sarstedt Inc | 62.515.006 | |
| Wooden plain-tipped applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | SKU: Y1625-250G |
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