Isolamento di lieviti e muffe coltivabili dai terreni per studiare la struttura della popolazione fungina
Summary
Questo protocollo è un metodo efficace e veloce per coltivare lieviti e la muffa Aspergillus fumigatus da grandi serie di campioni di terreno in appena 7 giorni. I metodi possono essere facilmente modificati per adattarsi a una gamma di mezzi di incubazione e temperature necessarie per gli esperimenti.
Abstract
Il suolo ospita un’incredibile quantità di vita microbica, con ogni grammo contenente fino a miliardi di cellule batteriche, archeali e fungine. I funghi multicellulari come muffe e funghi unicellulari, ampiamente definiti come lieviti, svolgono ruoli essenziali negli ecosistemi del suolo come decompositori di materiale organico e come fonti di cibo per altri abitanti del suolo. La diversità delle specie fungine nel suolo dipende da una moltitudine di fattori climatici come precipitazioni e temperatura, nonché dalle proprietà del suolo tra cui materia organica, pH e umidità. La mancanza di un adeguato campionamento ambientale, specialmente nelle regioni dell’Asia, dell’Africa, del Sud America e dell’America centrale, ostacola la caratterizzazione delle comunità fungine del suolo e la scoperta di nuove specie.
Abbiamo caratterizzato le comunità fungine del suolo in nove paesi in sei continenti utilizzando circa 4.000 campioni di suolo e un protocollo sviluppato in laboratorio per l’isolamento di lieviti e muffe. Questo protocollo inizia con l’arricchimento selettivo separato per i lieviti e la muffa clinicamente rilevante Aspergillus fumigatus, in mezzi liquidi mentre inibisce la crescita batterica. Le colonie risultanti vengono quindi trasferite in mezzi solidi e ulteriormente elaborate per ottenere colture pure, seguite dalla caratterizzazione genetica a valle. L’identità delle specie di lievito viene stabilita attraverso il sequenziamento della loro regione interna del distanziatore trascritto (ITS) del cluster genico dell’RNA ribosomiale nucleare, mentre la struttura della popolazione globale di A. fumigatus viene esplorata tramite l’analisi dei marcatori di microsatelliti.
Il protocollo è stato applicato con successo per isolare e caratterizzare le popolazioni di lievito del suolo e A. fumigatus in Camerun, Canada, Cina, Costa Rica, Islanda, Perù, Nuova Zelanda e Arabia Saudita. Questi risultati hanno rivelato approfondimenti tanto necessari sui modelli globali nella diversità del lievito del suolo, nonché sulla struttura della popolazione globale e sui profili di resistenza antifungina di A. fumigatus. Questo documento presenta il metodo per isolare sia i lieviti che A. fumigatus da campioni di suolo internazionali.
Introduction
I funghi negli ecosistemi del suolo svolgono ruoli essenziali nella decomposizione della materia organica, nel ciclo dei nutrienti e nella fertilizzazione del suolo1. Sia gli approcci indipendenti dalla coltura (cioè il sequenziamento ad alto rendimento) che gli approcci dipendenti dalla coltura sono ampiamente utilizzati nello studio dei funghi del suolo 2,3. Mentre la grande quantità di dati generati dal sequenziamento del metabarcodo ad alto rendimento è utile per chiarire modelli su larga scala nella struttura e nella diversità della comunità, l’approccio dipendente dalla cultura può fornire informazioni altamente complementari sulle strutture tassonomiche e funzionali delle comunità fungine, nonché profili più specifici dei singoli organismi attraverso la diversità a valle e le analisi funzionali dovute alla disponibilità di colture fungine pure.
Nonostante raramente superino migliaia di cellule per grammo di terreno, i lieviti, ampiamente definiti come funghi unicellulari, sono decompositori e fonti di cibo essenziali per altri abitanti del suolo 4,5. In effetti, i lieviti possono essere i funghi del suolo predominanti nelle biosfere fredde come l’Antartide continentale 6,7. Il suolo è anche un serbatoio primario di lieviti rilevanti dal punto di vista medico che causano gravi infezioni opportunistiche negli esseri umani e in altri mammiferi8. Nonostante le somiglianze morfologiche, le specie di lievito sono filogeneticamente diverse e si trovano tra i funghi filamentosi in due phyla principali, Ascomycota e Basidiomycota, all’interno del regno fungino9. I lieviti mancano di una firma del DNA che definisce il gene del codice a barre fungino, la regione interna del distanziatore trascritto (ITS) del cluster10 del gene dell’RNA ribosomiale nucleare, rendendoli indistinguibili da altri funghi nelle indagini di metagenomica e quindi rendendo necessario l’uso di metodi dipendenti dalla coltura per isolare le specie di lievito.
Il protocollo seguente è stato implementato per caratterizzare le comunità di lieviti del suolo di nove paesi e identificare tendenze e modelli globali nella diversità del lievito del suolo 9,11,12. Gli approcci di metagenomica sono di utilità limitata quando si studiano gruppi mirati di organismi come i lieviti 2,3. A causa della loro diversità filogenetica, i lieviti non possono essere distinti da altri funghi basati sulla sola sequenza di DNA. Pertanto, lo studio delle popolazioni di lieviti richiede l’uso continuato dell’isolamento dipendente dalla cultura. Tuttavia, la coltivazione è spesso significativamente più dispendiosa in termini di tempo e richiede più personale per eseguire gli esperimenti. Pertanto, il protocollo è stato ottimizzato e semplificato per un’elaborazione più rapida con personale limitato. Il vantaggio principale della coltivazione è che le specie di lievito identificate sono lieviti vivi e non morti, e quindi hanno maggiori probabilità di essere veri abitanti del suolo piuttosto che cellule transitorie presenti nei terreni. È stato stimato che circa il 40% del DNA fungino nel suolo sono contaminanti provenienti da altri ambienti, extracellulari, o provengono da cellule che non sono più intatte, causando approcci di sequenziamento ad alto rendimento per sovrastimare la ricchezza fungina fino al 55%13. L’isolamento dipendente dalla coltura può facilmente confermare l’identità delle specie di lievito con l’ulteriore vantaggio di garantire la coltura pura da utilizzare nelle analisi a valle. In effetti, colture pure di 44 nuove specie di lievito putativo sono state identificate utilizzando questo protocollo di isolamento del suolo che ha permesso l’uso di una serie di metodi per studiare le loro proprietà tassonomiche e funzionali in dettaglio14.
Il protocollo riportato di seguito può essere utilizzato anche per isolare le muffe presenti all’interno del suolo, come A. fumigatus. Aspergillus fumigatus è una muffa termofila e saprofita con un’ampia distribuzione globale nel suolo15. È stato isolato da numerosi ambienti clinici e non clinici. Il campionamento non clinico include comunemente aria, detriti organici (compost, segatura, rifiuti di bulbi di tulipani) e suolo (terreni agricoli, da giardino e naturali)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus è un patogeno opportunistico umano che causa una serie di infezioni collettivamente definite aspergillosi, che colpiscono oltre 8 milioni di persone in tutto il mondo16,20. Circa 300.000 persone in tutto il mondo soffrono di aspergillosi invasiva, che è la forma più grave di aspergillosi16. A seconda di fattori come la popolazione di pazienti, il sito di infezione e l’efficacia della terapia antifungina, il tasso di mortalità può arrivare fino al 90%. Negli ultimi decenni, la resistenza alle terapie antifungine è aumentata, richiedendo sforzi di sorveglianza globale sia nelle popolazioni cliniche che ambientali per tracciare questi genotipi di resistenza 21,22,23. Data la sua capacità di crescere a temperature superiori a 50 °C, questa temperatura può essere sfruttata per selezionare isolati di A. fumigatus dal suolo utilizzando metodi dipendenti dalla coltura. Gli isolati di Aspergillus fumigatus sono comunemente genotipizzati in nove loci a ripetizione tandem breve (STR) altamente polimorfici, che hanno dimostrato di avere un elevato potere discriminatorio tra i ceppi24. Questi genotipi STR possono essere confrontati con altre popolazioni precedentemente intervistate per tracciare la diffusione dei genotipi di A. fumigatus, compresi i geni di resistenza ai farmaci, in tutto il mondo.
Di seguito descriviamo un protocollo per il rapido isolamento di lieviti e A. fumigatus da campioni di terreno in modo dipendente dalla coltura. A seconda della quantità di terreno ottenuta per campione, i campioni di terreno possono essere condivisi tra i due protocolli. Rispetto a metodi simili che isolano il lievito e A. fumigatus dal suolo, questo protocollo utilizza 10 volte meno terreno per isolato ottenuto. Gli studi che tentano di isolare A. fumigatus dal suolo richiedono tra 1 e 2 g di terreno per isolato, mentre questo protocollo richiede solo 0,1-0,2 g diterreno 18,19,25. Questo protocollo utilizza plastiche e contenitori più piccoli che facilitano la sua progettazione ad alta produttività. Pertanto, un numero maggiore di campioni può essere elaborato utilizzando meno spazio per attrezzature come incubatori e tamburi a rulli. I campioni di terreno possono essere completamente elaborati per ottenere isolati in appena 7 giorni. Questo protocollo è stato ottimizzato per consentire l’elaborazione di un massimo di 150-200 campioni al giorno a persona.
Protocol
Representative Results
Discussion
Il protocollo sviluppato per isolare lieviti e A. fumigatus dal suolo è un metodo rapido ed efficiente per la lavorazione del suolo ad alto rendimento e l’isolamento fungino. Il protocollo richiede solo una piccola quantità di terreno (0,1-0,2 g) per campione, consentendo di campionare più siti con uno sforzo simile. I tempi di consegna rapidi assicurano che i risultati possano essere ottenuti in un breve lasso di tempo e consentono di risolvere i problemi e ripetere gli esperimenti, se necessario. Questo pro…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questa ricerca è stata sostenuta da sovvenzioni del Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant No. ALLRP 570780-2021) e McMaster University.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt Inc | 72.690.001 | |
| Benomyl powder | Toronto Research Chemicals | B161380 | |
| Chloramphenicol powder | Sigma-Aldrich | SKU: C0378-5G | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | SKU: D9434-500G | |
| Fragment Analysis Software | NCBI's Osiris | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/ | |
| ITS sequence database | NCBI GenBank | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ | |
| ITS sequence database | UNITE | https://unite.ut.ee/ | |
| Peptone | Sigma-Aldrich | SKU: P5905-500G | |
| Reusable cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-12 | |
| Sterile 10 cm diameter Petri dishes | Sarstedt Inc | 83.3902 | |
| Sterile 13 mL culture tubes | Sarstedt Inc | 62.515.006 | |
| Wooden plain-tipped applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | SKU: Y1625-250G |
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