Isolering av dyrkbar gjær og mugg fra jord for å undersøke sopppopulasjonsstruktur

Summary

Denne protokollen er en effektiv, rask metode for dyrking av gjær og formen Aspergillus fumigatus fra store sett med jordprøver på så lite som 7 dager. Metodene kan enkelt modifiseres for å imøtekomme en rekke inkubasjonsmedier og temperaturer etter behov for eksperimenter.

Abstract

Jord er vert for en utrolig mengde mikrobielt liv, med hvert gram som inneholder opptil milliarder bakterielle, arkeale og soppceller. Multicellulære sopp som mugg og encellede sopp, bredt definert som gjær, oppfyller viktige roller i jordøkosystemer som nedbrytere av organisk materiale og som matkilder for andre jordboere. Svampeartenes mangfold i jord er avhengig av en rekke klimatiske faktorer som nedbør og temperatur, samt jordegenskaper, inkludert organisk materiale, pH og fuktighet. Mangel på tilstrekkelig miljøprøvetaking, spesielt i regioner i Asia, Afrika, Sør-Amerika og Mellom-Amerika, hindrer karakterisering av jordsoppsamfunn og oppdagelsen av nye arter.

Vi karakteriserte jordsoppsamfunn i ni land på seks kontinenter ved hjelp av ~ 4000 jordprøver og en protokoll utviklet i laboratoriet for isolering av gjær og mugg. Denne protokollen begynner med separat selektiv anrikning for gjær og den medisinsk relevante formen Aspergillus fumigatus, i flytende medier mens den hemmer bakterievekst. Resulterende kolonier overføres deretter til faste medier og viderebehandles for å oppnå rene kulturer, etterfulgt av nedstrøms genetisk karakterisering. Gjærartens identitet etableres via sekvensering av deres interne transkriberte spacer (ITS) -region av den nukleære ribosomale RNA-genklyngen, mens den globale populasjonsstrukturen til A. fumigatus utforskes via mikrosatellittmarkøranalyse.

Protokollen ble vellykket brukt til å isolere og karakterisere jordgjær og A. fumigatuspopulasjoner i Kamerun, Canada, Kina, Costa Rica, Island, Peru, New Zealand og Saudi-Arabia. Disse funnene avslørte sårt tiltrengt innsikt i globale mønstre i jordgjærdiversitet, samt global befolkningsstruktur og antifungale motstandsprofiler av A. fumigatus. Denne artikkelen presenterer metoden for å isolere både gjær og A. fumigatus fra internasjonale jordprøver.

Introduction

Sopp i jordøkosystemer spiller viktige roller i nedbrytning av organisk materiale, næringssyklus og jordgjødsel¹. Både kulturuavhengige (dvs. høykapasitetssekvensering) og kulturavhengige tilnærminger er mye brukt i studiet av jordsvamp ^2,3. Mens den store mengden data som genereres av metabarkodesekvensering med høy gjennomstrømning er nyttig for å belyse brede mønstre i samfunnsstruktur og mangfold, kan den kulturavhengige tilnærmingen gi svært komplementær informasjon om de taksonomiske og funksjonelle strukturer i soppsamfunn, samt mer spesifikke profiler av individuelle organismer gjennom nedstrøms mangfold og funksjonelle analyser på grunn av tilgjengeligheten av rene soppkulturer.

Til tross for sjelden overskridelse av tusenvis av celler per gram jord, er gjær, bredt definert som encellede sopp, essensielle nedbrytere og matkilder for andre jordboere ^4,5. Faktisk kan gjær være den dominerende jordsoppen i kalde biosfærer som kontinental Antarktis ^6,7. Jord er også et primært reservoar av medisinsk relevante gjær som forårsaker alvorlige opportunistiske infeksjoner hos mennesker og andre pattedyr⁸. Til tross for morfologiske likheter er gjærarter fylogenetisk mangfoldige og forekommer blant filamentøse sopp i to store phyla, Ascomycota og Basidiomycota, innenfor soppriket⁹. Gjær mangler en definerende DNA-signatur ved soppstrekkodingsgenet, den interne transkriberte avstandsstykket (ITS) -regionen i den nukleære ribosomale RNA-genklyngen¹⁰, noe som gjør dem umulige å skille fra andre sopp i metagenomikkundersøkelser og dermed nødvendiggjør bruk av kulturavhengige metoder for å isolere gjærarter.

Protokollen nedenfor ble implementert for å karakterisere jordgjærsamfunn i ni land og identifisere globale trender og mønstre i jordgjærdiversitet ^9,11,12. Metagenomikk tilnærminger er av begrenset bruk når man studerer målrettede grupper av organismer som gjær ^2,3. På grunn av deres fylogenetiske mangfold kan gjær ikke skilles fra andre sopp basert på DNA-sekvens alene. Dermed krever studier av gjærpopulasjoner fortsatt bruk av kulturavhengig isolasjon. Dyrking er imidlertid ofte betydelig mer tidkrevende og krever mer personell til å utføre forsøkene. Derfor har protokollen blitt optimalisert og strømlinjeformet for raskere behandling med begrenset personell. Den største fordelen med dyrking er at de identifiserte gjærartene er levende gjær og ikke døde, og dermed er det mer sannsynlig at de er sanne jordboere i stedet for forbigående celler som er tilstede i jordene. Det har blitt anslått at omtrent 40% av sopp-DNA i jord enten er forurensninger fra andre miljøer, ekstracellulære, eller kommer fra celler som ikke lenger er intakte, noe som forårsaker sekvenseringsmetoder med høy gjennomstrømning for å overvurdere sopprikdom med så mye som 55% ¹³. Kulturavhengig isolasjon kan lett bekrefte gjærartens identitet med den ekstra fordelen av å sikre ren kultur som skal brukes i nedstrømsanalyser. Faktisk ble rene kulturer av 44 antatte nye gjærarter identifisert ved hjelp av denne jordisolasjonsprotokollen som tillot bruk av en rekke metoder for å studere deres taksonomiske og funksjonelle egenskaper i detalj¹⁴.

Protokollen nedenfor kan også brukes til å isolere muggsopp som finnes i jord, for eksempel A. fumigatus. Aspergillus fumigatus er en termofil og saprofytisk form med en bred, global fordeling i jord¹⁵. Det har blitt isolert fra mange kliniske og ikke-kliniske miljøer. Ikke-klinisk prøvetaking inkluderer vanligvis luft, organisk avfall (kompost, sagstøv, tulipanpæreavfall) og jord (landbruks-, hage- og naturlig jord)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus er et humant opportunistisk patogen som forårsaker en rekke infeksjoner som samlet kalles aspergillose, som påvirker over 8 millioner mennesker over hele verden^16,20. Omtrent 300 000 mennesker over hele verden lider av invasiv aspergillose, som er den mest alvorlige formen for aspergillose¹⁶. Avhengig av faktorer som pasientpopulasjonen, infeksjonsstedet og effekten av antifungal terapi, kan dødeligheten være så høy som 90%. I løpet av de siste tiårene har motstanden mot antifungal terapi økt, noe som krever global overvåkingsinnsats i både kliniske og miljømessige populasjoner for å spore disse resistensgenotypene 21,22,23. Gitt sin evne til å vokse ved temperaturer over 50 ° C, kan denne temperaturen utnyttes til å velge for A. fumigatus isolater fra jord ved hjelp av kulturavhengige metoder. Aspergillus fumigatus isolater genotypes vanligvis ved ni svært polymorfe korte tandem repeterende (STR) loci, vist å ha høy diskriminerende kraft mellom stammer²⁴. Disse STR-genotypene kan sammenlignes med andre tidligere undersøkte populasjoner for å spore spredningen av A. fumigatus-genotyper, inkludert stoffresistensgener, rundt om i verden.

Nedenfor beskriver vi en protokoll for rask isolering av gjær og A. fumigatus fra jordprøver på en kulturavhengig måte. Avhengig av mengden jord oppnådd per prøve, kan jordprøvene deles mellom de to protokollene. Sammenlignet med lignende metoder som isolerer gjær og A. fumigatus fra jord, bruker denne protokollen 10 ganger mindre jord per oppnådd isolat. Studier som forsøker å isolere A. fumigatus fra jord krever mellom 1 og 2 g jord per isolat, mens denne protokollen krever bare 0,1-0,2 g jord 18,19,25. Denne protokollen benytter mindre plast og beholdere som letter den høye gjennomstrømningsdesignen. Derfor kan et større antall prøver behandles med mindre plass til utstyr som inkubatorer og rulletromler. Jordprøver kan behandles fullt ut for å oppnå isolater på så lite som 7 dager. Denne protokollen er optimalisert for å tillate behandling av opptil 150-200 prøver per dag per person.

Protocol

MERK: Eventuelle trinn ved bruk av internasjonale jordprøver og / eller A. fumigatussporer og mycelia krever arbeid i et biosikkerhetsskap for nivå 2 organismer (BSCII). 1. Isolering av gjær fra jord Fremstilling av antibakterielle og antifungale løsninger Suspend kloramfenikolpulver i 70% etanol for å fremstille en 50 g / L stamløsning. Steriliser ved sprøytefiltrering og oppbevar ved 4 °C.MERK: Dette antibiotikumet vil forhindre vekst a…

Representative Results

Gjærisolasjon fra jordOvennevnte gjærisolasjonsprotokoll ble implementert for å dyrke gjær fra jordprøver som stammer fra 53 steder i ni land 9,12. Totalt ble 1.473 gjærstammer isolert fra 3.826 jordprøver. Gitt de forskjellige klimatiske forholdene i de ni opprinnelseslandene, ble den beste inkubasjonstemperaturen for hvert land bestemt basert på den gjennomsnittlige årlige temperaturen (tabell 1). Gitt den langsomm…

Discussion

Protokollen utviklet for isolering av gjær og A. fumigatus fra jord er en rask og effektiv metode for jordbehandling og soppisolering med høy gjennomstrømning. Protokollen krever bare en liten mengde jord (0,1-0,2 g) per prøve, slik at flere steder kan prøves med lignende innsats. Den raske behandlingstiden sikrer at resultatene kan oppnås innen en kort tidsramme og gir tid til feilsøking og gjentatte eksperimenter om nødvendig. Denne protokollen kan enkelt replikeres på tvers av mange laboratorieinnsti…

Materials

1.5 mL microcentrifuge tube	Sarstedt Inc	72.690.001
Benomyl powder	Toronto Research Chemicals	B161380
Chloramphenicol powder	Sigma-Aldrich	SKU: C0378-5G
Dextrose	Sigma-Aldrich	SKU: D9434-500G
Fragment Analysis Software	NCBI's Osiris		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/
ITS sequence database	NCBI GenBank		https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
ITS sequence database	UNITE		https://unite.ut.ee/
Peptone	Sigma-Aldrich	SKU: P5905-500G
Reusable cell spreaders	Fisher Scientific	08-100-12
Sterile 10 cm diameter Petri dishes	Sarstedt Inc	83.3902
Sterile 13 mL culture tubes	Sarstedt Inc	62.515.006
Wooden plain-tipped applicator sticks	Fisher Scientific	23-400-112
Yeast extract	Sigma-Aldrich	SKU: Y1625-250G