Isolering av odlingsbara jästar och mögel från jordar för att undersöka svamppopulationsstruktur
Summary
Detta protokoll är en effektiv, snabb metod för odling av jäst och mögel Aspergillus fumigatus från stora uppsättningar jordprover på så lite som 7 dagar. Metoderna kan enkelt modifieras för att rymma en rad inkubationsmedier och temperaturer efter behov för experiment.
Abstract
Jord är värd för en otrolig mängd mikrobiellt liv, där varje gram innehåller upp till miljarder bakterie-, arkeala och svampceller. Flercelliga svampar som mögel och encelliga svampar, brett definierade som jäst, fyller viktiga roller i markens ekosystem som sönderdelare av organiskt material och som matkällor för andra jordbor. Svamparternas mångfald i marken är beroende av en mängd klimatfaktorer som nederbörd och temperatur, liksom markegenskaper inklusive organiskt material, pH och fukt. Brist på adekvat miljöprovtagning, särskilt i regioner i Asien, Afrika, Sydamerika och Centralamerika, hindrar karakteriseringen av marksvampsamhällen och upptäckten av nya arter.
Vi karakteriserade jordsvampsamhällen i nio länder på sex kontinenter med hjälp av ~ 4 000 jordprover och ett protokoll som utvecklats i laboratoriet för isolering av jäst och mögel. Detta protokoll börjar med separat selektiv anrikning för jäst och den medicinskt relevanta formen Aspergillus fumigatus, i flytande media samtidigt som bakterietillväxt hämmas. Resulterande kolonier överförs sedan till fasta medier och bearbetas vidare för att erhålla rena kulturer, följt av nedströms genetisk karakterisering. Jästartsidentiteten fastställs genom sekvensering av deras inre transkriberade distansregion (ITS) i det nukleära ribosomala RNA-genklustret, medan den globala populationsstrukturen för A. fumigatus utforskas via mikrosatellitmarköranalys.
Protokollet tillämpades framgångsrikt för att isolera och karakterisera jordjäst och A. fumigatuspopulationer i Kamerun, Kanada, Kina, Costa Rica, Island, Peru, Nya Zeeland och Saudiarabien. Dessa fynd avslöjade välbehövliga insikter om globala mönster i markjästdiversitet, liksom global befolkningsstruktur och svampdödande resistensprofiler för A. fumigatus. Detta dokument presenterar metoden för att isolera både jäst och A. fumigatus från internationella jordprover.
Introduction
Svampar i markens ekosystem spelar viktiga roller i nedbrytning av organiskt material, näringscykel och markgödsling1. Både kulturoberoende (dvs. sekvensering med hög genomströmning) och kulturberoende metoder används ofta i studien av marksvampar 2,3. Medan den stora mängden data som genereras av metabarkodsekvensering med hög genomströmning är användbar för att belysa storskaliga mönster i samhällsstruktur och mångfald, kan det kulturberoende tillvägagångssättet ge mycket kompletterande information om de taxonomiska och funktionella strukturerna i svampsamhällen, liksom mer specifika profiler av enskilda organismer genom nedströms mångfald och funktionella analyser på grund av tillgången på rena svampkulturer.
Trots att de sällan överstiger tusentals celler per gram jord, är jäst, brett definierad som encelliga svampar, viktiga sönderdelare och matkällor för andra jordbor 4,5. Faktum är att jäst kan vara de dominerande marksvamparna i kalla biosfärer som kontinentala Antarktis 6,7. Jord är också en primär reservoar av medicinskt relevanta jästsvampar som orsakar allvarliga opportunistiska infektioner hos människor och andra däggdjur8. Trots morfologiska likheter är jästarter fylogenetiskt olika och förekommer bland trådformiga svampar i två stora phyla, Ascomycota och Basidiomycota, inom svampriket9. Jäst saknar en definierande DNA-signatur vid svampbarkodningsgenen, den interna transkriberade distansregionen (ITS) i det nukleära ribosomala RNA-genklustret10, vilket gör dem oskiljbara från andra svampar i metagenomiska undersökningar och därmed kräver användning av kulturberoende metoder för att isolera jästarter.
Protokollet nedan implementerades för att karakterisera jordjästsamhällen i nio länder och identifiera globala trender och mönster i markjästdiversitet 9,11,12. Metagenomiska metoder är av begränsad nytta när man studerar riktade grupper av organismer såsom jäst 2,3. På grund av deras fylogenetiska mångfald kan jäst inte särskiljas från andra svampar baserat på DNA-sekvens ensam. Att studera jästpopulationer kräver således fortsatt användning av kulturberoende isolering. Odling är dock ofta betydligt mer tidskrävande och kräver mer personal för att utföra experimenten. Därför har protokollet optimerats och effektiviserats för snabbare bearbetning med begränsad personal. Den största fördelen med odling är att de identifierade jästarterna är levande jäst och inte döda, och därmed är mer benägna att vara sanna jordbor snarare än övergående celler som finns i jordarna. Det har uppskattats att cirka 40% av svamp-DNA i jord antingen är föroreningar från andra miljöer, extracellulära eller kommer från celler som inte längre är intakta, vilket orsakar sekvenseringsmetoder med hög genomströmning för att överskatta svamprikedomen med så mycket som 55%13. Kulturberoende isolering kan lätt bekräfta jästartsidentitet med den extra fördelen att säkerställa ren kultur som kan användas i nedströmsanalyser. Faktum är att rena kulturer av 44 förmodade nya jästarter identifierades med hjälp av detta jordisoleringsprotokoll som möjliggjorde användningen av en rad metoder för att studera deras taxonomiska och funktionella egenskaper i detalj14.
Protokollet nedan kan också användas för att isolera mögel som finns i jord, såsom A. fumigatus. Aspergillus fumigatus är en termofil och saprofytisk form med en bred, global fördelning i jord15. Det har isolerats från många kliniska och icke-kliniska miljöer. Icke-klinisk provtagning inkluderar vanligtvis luft, organiskt skräp (kompost, sågdamm, tulpanlökavfall) och jord (jordbruks-, trädgårds- och naturjord)16,17,18,19. Aspergillus fumigatus är en mänsklig opportunistisk patogen som orsakar en rad infektioner som kollektivt kallas aspergillos, som påverkar över 8 miljoner människor världen över16,20. Cirka 300 000 människor runt om i världen lider av invasiv aspergillos, vilket är den allvarligaste formen av aspergillos16. Beroende på faktorer som patientpopulationen, infektionsstället och effekten av svampdödande behandling kan dödligheten vara så hög som 90%. Under de senaste decennierna har resistensen mot svampdödande terapier ökat, vilket kräver globala övervakningsinsatser i både kliniska och miljömässiga populationer för att spåra dessa resistensgenotyper 21,22,23. Med tanke på dess förmåga att växa vid temperaturer upp till 50 ° C kan denna temperatur utnyttjas för att välja för A. fumigatusisolat från jord med hjälp av kulturberoende metoder. Aspergillus fumigatus-isolat är vanligtvis genotypade vid nio mycket polymorfa korta tandemupprepning (STR) loci, som visat sig ha hög diskriminerande effekt mellan stammar24. Dessa STR-genotyper kan jämföras med andra tidigare undersökta populationer för att spåra spridningen av A. fumigatus-genotyper, inklusive läkemedelsresistensgener, runt om i världen.
Nedan beskriver vi ett protokoll för snabb isolering av jäst och A. fumigatus från jordprover på ett kulturberoende sätt. Beroende på mängden jord som erhålls per prov kan jordproverna delas mellan de två protokollen. I jämförelse med liknande metoder som isolerar jäst och A. fumigatus från jord, använder detta protokoll 10 gånger mindre jord per erhållet isolat. Studier som försöker isolera A. fumigatus från jord kräver mellan 1 och 2 g jord per isolat, medan detta protokoll endast kräver 0,1-0,2 g jord 18,19,25. Detta protokoll använder mindre plast och behållare som underlättar dess design med hög genomströmning. Därför kan ett större antal prover bearbetas med mindre utrymme för utrustning som inkubatorer och rulltrummor. Jordprover kan bearbetas fullständigt för att få isolat på så lite som 7 dagar. Detta protokoll har optimerats för att möjliggöra bearbetning av upp till 150-200 prover per dag och person.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokollet som utvecklats för att isolera jäst och A. fumigatus från jord är en snabb och effektiv metod för jordbearbetning med hög kapacitet och svampisolering. Protokollet kräver endast en liten mängd jord (0,1-0,2 g) per prov, vilket gör att fler platser kan provtas med liknande ansträngning. Den snabba handläggningstiden säkerställer att resultat kan erhållas inom en kort tidsram och ger tid för felsökning och upprepning av experiment vid behov. Detta protokoll kan enkelt replikeras över m…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Denna forskning stöddes av bidrag från Natural Sciences and Engineering Research Council of Canada (Grant No. ALLRP 570780-2021) och McMaster University.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt Inc | 72.690.001 | |
| Benomyl powder | Toronto Research Chemicals | B161380 | |
| Chloramphenicol powder | Sigma-Aldrich | SKU: C0378-5G | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | SKU: D9434-500G | |
| Fragment Analysis Software | NCBI's Osiris | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/ | |
| ITS sequence database | NCBI GenBank | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ | |
| ITS sequence database | UNITE | https://unite.ut.ee/ | |
| Peptone | Sigma-Aldrich | SKU: P5905-500G | |
| Reusable cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-12 | |
| Sterile 10 cm diameter Petri dishes | Sarstedt Inc | 83.3902 | |
| Sterile 13 mL culture tubes | Sarstedt Inc | 62.515.006 | |
| Wooden plain-tipped applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | SKU: Y1625-250G |
References
- Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., Jȩdryczka, M. Fungal biodiversity and their role in soil health. Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).
- Tedersoo, L., et al. Global diversity and geography of soil fungi. Science. 346 (6213), 1256688 (2014).
- Egidi, E., et al. A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
- Yurkov, A. M. Yeasts of the soil – obscure but precious. Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).
- Botha, A. The importance and ecology of yeasts in soil. Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).
- Connell, L., et al. Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica. Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).
- Vishniac, H. S. A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient. Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).
- Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. . The Yeasts: A Taxonomic Study. , (2011).
- Samarasinghe, H., et al. Global patterns in culturable soil yeast diversity. iScience. 24 (10), 103098 (2021).
- Xu, J. Fungal DNA barcoding. Genome. 59 (11), 913-932 (2016).
- Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils. FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).
- Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).
- Xu, J. Fungal species concepts in the genomics era. Genome. 63 (9), 459-468 (2020).
- Brakhage, A. A., Langfelder, K. Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus. Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
- Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).
- Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate. Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).
- Chowdhary, A., et al. Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India. PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen. PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).
- Sewell, T. R., et al. Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus. mBio. 10 (3), 00392 (2019).
- Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus. mSphere. 2 (1), 00019 (2017).
- Heo, S. T., et al. Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015. Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).
- de Valk, H. A., et al. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates. Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).
- Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes. Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).
- Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process. Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).
- Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. Isolation and characterization of mutations in the Β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 111 (4), 715-734 (1985).
- Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans. Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).
- Paoletti, M., et al. Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).
- De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).
- Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting linear mixed-effects models using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
- Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. BLAST ® Command Line Applications User Manual. National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).
- Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon. Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).
- Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils. Genes. 13 (1), 19 (2021).
- Snelders, E., et al. Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles. Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).
- Wang, H. -. C., et al. mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan. Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).
