Mantar Popülasyon Yapısını Araştırmak için Kültürlenebilir Maya ve Küflerin Topraklardan İzolasyonu
Summary
Bu protokol, mayaların ve küf Aspergillus fumigatus’un 7 gün gibi kısa bir sürede büyük toprak numunelerinden kültürlenmesi için etkili ve hızlı bir yöntemdir. Yöntemler, deneyler için gerektiğinde bir dizi inkübasyon ortamına ve sıcaklığına uyum sağlamak için kolayca değiştirilebilir.
Abstract
Toprak, inanılmaz miktarda mikrobiyal yaşama ev sahipliği yapar ve her gram milyarlarca bakteriyel, arkeal ve mantar hücresi içerir. Genel olarak mayalar olarak tanımlanan küfler ve tek hücreli mantarlar gibi çok hücreli mantarlar, toprak ekosistemlerinde organik malzemenin ayrıştırıcıları ve diğer toprak sakinleri için besin kaynakları olarak önemli roller üstlenirler. Topraktaki mantar türü çeşitliliği, yağış ve sıcaklık gibi çok sayıda iklim faktörünün yanı sıra organik madde, pH ve nem gibi toprak özelliklerine bağlıdır. Özellikle Asya, Afrika, Güney Amerika ve Orta Amerika bölgelerinde yeterli çevresel örneklemenin olmaması, toprak mantar topluluklarının karakterizasyonunu ve yeni türlerin keşfedilmesini engellemektedir.
Altı kıtada dokuz ülkedeki toprak mantar topluluklarını ~ 4.000 toprak örneği ve mayaların ve küflerin izolasyonu için laboratuvarda geliştirilen bir protokol kullanarak karakterize ettik. Bu protokol, mayalar ve tıbbi olarak ilgili küf Aspergillus fumigatus için ayrı seçici zenginleştirme ile başlar, sıvı ortamda, bakteri büyümesini inhibe ederken. Elde edilen koloniler daha sonra katı ortama aktarılır ve saf kültürler elde etmek için daha fazla işlenir, ardından aşağı akış genetik karakterizasyonu yapılır. Maya türü kimliği, nükleer ribozomal RNA gen kümesinin iç transkribe edilmiş aralayıcı (ITS) bölgesinin sıralanması yoluyla belirlenirken, A. fumigatus’un küresel popülasyon yapısı mikrosatellit belirteç analizi ile araştırılmaktadır.
Protokol, Kamerun, Kanada, Çin, Kosta Rika, İzlanda, Peru, Yeni Zelanda ve Suudi Arabistan’daki toprak mayası ve A. fumigatus popülasyonlarını izole etmek ve karakterize etmek için başarıyla uygulandı. Bu bulgular, toprak mayası çeşitliliğindeki küresel modellerin yanı sıra A. fumigatus’un küresel popülasyon yapısı ve antifungal direnç profilleri hakkında çok ihtiyaç duyulan içgörüleri ortaya koydu. Bu yazıda hem mayaların hem de A. fumigatus’un uluslararası toprak örneklerinden izole edilmesi yöntemi sunulmaktadır.
Introduction
Toprak ekosistemlerindeki mantarlar organik madde ayrışması, besin döngüsü ve toprak gübrelemesinde önemli roller oynamaktadır1. Hem kültürden bağımsız (yani, yüksek verimli dizileme) hem de kültüre bağımlı yaklaşımlar, toprak mantarlarının incelenmesinde yaygın olarak kullanılmaktadır 2,3. Yüksek verimli metabarkod dizilemesi ile üretilen büyük miktarda veri, topluluk yapısı ve çeşitliliğindeki geniş ölçekli kalıpları aydınlatmak için yararlı olsa da, kültüre bağımlı yaklaşım, mantar topluluklarının taksonomik ve fonksiyonel yapıları hakkında oldukça tamamlayıcı bilgilerin yanı sıra, saf mantar kültürlerinin mevcudiyeti nedeniyle aşağı akış çeşitliliği ve fonksiyonel analizler yoluyla bireysel organizmaların daha spesifik profilleri hakkında da oldukça tamamlayıcı bilgiler sağlayabilir.
Toprağın gramı başına binlerce hücreyi nadiren aşmasına rağmen, geniş ölçüde tek hücreli mantarlar olarak tanımlanan mayalar, diğer toprak sakinleri için temel ayrıştırıcılar ve besin kaynaklarıdır 4,5. Aslında, mayalar kıtasal Antarktika 6,7 gibi soğuk biyosferlerde baskın toprak mantarları olabilir. Toprak aynı zamanda insanlarda ve diğer memelilerde ciddi fırsatçı enfeksiyonlara neden olan tıbbi olarak ilgili mayaların birincil rezervuarıdır8. Morfolojik benzerliklere rağmen, maya türleri filogenetik olarak çeşitlidir ve mantar krallığı9 içindeki iki ana filumda, Ascomycota ve Basidiomycota’da filamentli mantarlar arasında görülür. Mayalar, mantar barkodlama geninde, nükleer ribozomal RNA gen kümesi10’un iç transkribe edilmiş ara parçası (ITS) bölgesinde tanımlayıcı bir DNA imzasından yoksundur, bu da onları metagenomik araştırmalarda diğer mantarlardan ayırt edilemez hale getirir ve bu nedenle maya türlerini izole etmek için kültüre bağımlı yöntemlerin kullanılmasını gerektirir.
Aşağıdaki protokol, dokuz ülkenin toprak mayası topluluklarını karakterize etmek ve toprak mayası çeşitliliğindeki küresel eğilimleri ve kalıpları belirlemekiçin uygulanmıştır 9,11,12. Metagenomik yaklaşımlar, mayalar 2,3 gibi hedeflenen organizma gruplarını incelerken sınırlı bir şekilde kullanılmaktadır. Filogenetik çeşitliliği nedeniyle, mayalar sadece DNA dizisine dayanan diğer mantarlardan ayırt edilemez. Bu nedenle, maya popülasyonlarını incelemek, kültüre bağımlı izolasyonun sürekli kullanımını gerektirir. Bununla birlikte, kültürleme genellikle önemli ölçüde daha fazla zaman alıcıdır ve deneyleri gerçekleştirmek için daha fazla personel gerektirir. Bu nedenle, protokol sınırlı personelle daha hızlı işlem için optimize edilmiş ve kolaylaştırılmıştır. Kültürlemenin temel avantajı, tanımlanan maya türlerinin ölü değil canlı mayalar olması ve bu nedenle topraklarda bulunan geçici hücrelerden ziyade gerçek toprak sakinleri olma ihtimalinin daha yüksek olmasıdır. Topraktaki mantar DNA’sının yaklaşık% 40’ının ya diğer ortamlardan, hücre dışı kirleticiler olduğu ya da artık bozulmamış hücrelerden geldiği ve mantar zenginliğini% 55’e kadar abartmak için yüksek verimli dizileme yaklaşımlarına neden olduğu tahmin edilmektedir13. Kültüre bağlı izolasyon, aşağı akış analizlerinde kullanılacak saf kültürün güvence altına alınmasının ek yararı ile maya türlerinin kimliğini kolayca doğrulayabilir. Gerçekten de, 44 varsayılan yeni maya türünün saf kültürleri, taksonomik ve fonksiyonel özelliklerini ayrıntılı olarak incelemek için bir dizi yöntemin kullanılmasına izin veren bu toprak izolasyon protokolü kullanılarak tanımlanmıştır14.
Aşağıdaki protokol, A. fumigatus gibi toprakta bulunan küfleri izole etmek için de kullanılabilir. Aspergillus fumigatus, toprakta geniş, küresel bir dağılıma sahip termofilik ve saprofitik bir küftür15. Çok sayıda klinik ve klinik olmayan ortamdan izole edilmiştir. Klinik olmayan örnekleme genellikle hava, organik döküntü (kompost, testere tozu, lale soğanı atığı) ve toprağı (tarımsal, bahçe ve doğal topraklar) içerir16,17,18,19. Aspergillus fumigatus, dünya çapında 8 milyondan fazla insanı etkileyen, toplu olarak aspergilloz olarak adlandırılan bir dizi enfeksiyona neden olan insan fırsatçı bir patojendir16,20. Dünya çapında yaklaşık 300.000 kişi, aspergillozun en şiddetli şekli olan invaziv aspergillozdan muzdariptir16. Hasta popülasyonu, enfeksiyon yeri ve antifungal tedavinin etkinliği gibi faktörlere bağlı olarak mortalite oranı %90 gibi yüksek olabilmektedir. Son birkaç on yılda, antifungal tedavilere karşı direnç artmış ve bu direnç genotiplerini izlemek için hem klinik hem de çevresel popülasyonlarda küresel sürveyans çabaları gerektirmiştir21,22,23. 50 ° C’ye kadar olan sıcaklıklarda büyüme kabiliyeti göz önüne alındığında, bu sıcaklık, kültüre bağlı yöntemler kullanılarak topraktan A. fumigatus izolatlarını seçmek için kullanılabilir. Aspergillus fumigatus izolatları genellikle dokuz yüksek polimorfik kısa tandem tekrar (STR) lokusunda genotiplendirilir ve suşlar24 arasında yüksek ayırt edici güce sahip olduğu gösterilmiştir. Bu STR genotipleri, ilaca dirençli genler de dahil olmak üzere A. fumigatus genotiplerinin dünya çapında yayılmasını izlemek için daha önce araştırılan diğer popülasyonlarla karşılaştırılabilir.
Aşağıda, mayaların ve A. fumigatus’un toprak örneklerinden kültüre bağlı bir şekilde hızlı bir şekilde izole edilmesi için bir protokol açıklanmaktadır. Numune başına elde edilen toprak miktarına bağlı olarak, toprak örnekleri iki protokol arasında paylaşılabilir. Maya ve A. fumigatus’u topraktan izole eden benzer yöntemlerle karşılaştırıldığında, bu protokol elde edilen izolatın başına 10 kat daha az toprak kullanır. A. fumigatus’u topraktan izole etmeye çalışan çalışmalar, izolat başına 1 ila 2 g toprak gerektirirken, bu protokol sadece 0.1-0.2 g toprak18,19,25 gerektirir. Bu protokol, yüksek verimli tasarımını kolaylaştıran daha küçük plastikler ve kaplar kullanır. Bu nedenle, inkübatörler ve makaralı variller gibi ekipmanlar için daha az alan kullanılarak daha fazla sayıda numune işlenebilir. Toprak örnekleri, 7 gün gibi kısa bir sürede izolatlar elde etmek için tamamen işlenebilir. Bu protokol, kişi başına günde 150-200 numunenin işlenmesine izin verecek şekilde optimize edilmiştir.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mayaların ve A. fumigatus’un topraktan izole edilmesi için geliştirilen protokol, yüksek verimli toprak işleme ve mantar izolasyonu için hızlı ve verimli bir yöntemdir. Protokol, numune başına sadece az miktarda toprak (0.1-0.2 g) gerektirir ve bu da benzer çabayla daha fazla alanın örneklenmesini sağlar. Hızlı geri dönüş süresi, sonuçların kısa bir zaman dilimi içinde elde edilebilmesini sağlar ve gerekirse sorun giderme ve denemelerin tekrarlanması için zaman tanır. Bu protokol, st…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Bu araştırma, Kanada Doğa Bilimleri ve Mühendislik Araştırma Konseyi’nden gelen hibelerle desteklenmiştir (Hibe No. ALLRP 570780-2021) ve McMaster Üniversitesi.
Materials
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt Inc | 72.690.001 | |
| Benomyl powder | Toronto Research Chemicals | B161380 | |
| Chloramphenicol powder | Sigma-Aldrich | SKU: C0378-5G | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | SKU: D9434-500G | |
| Fragment Analysis Software | NCBI's Osiris | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/ | |
| ITS sequence database | NCBI GenBank | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ | |
| ITS sequence database | UNITE | https://unite.ut.ee/ | |
| Peptone | Sigma-Aldrich | SKU: P5905-500G | |
| Reusable cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-12 | |
| Sterile 10 cm diameter Petri dishes | Sarstedt Inc | 83.3902 | |
| Sterile 13 mL culture tubes | Sarstedt Inc | 62.515.006 | |
| Wooden plain-tipped applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | SKU: Y1625-250G |
References
- Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., Jȩdryczka, M. Fungal biodiversity and their role in soil health. Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).
- Tedersoo, L., et al. Global diversity and geography of soil fungi. Science. 346 (6213), 1256688 (2014).
- Egidi, E., et al. A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
- Yurkov, A. M. Yeasts of the soil – obscure but precious. Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).
- Botha, A. The importance and ecology of yeasts in soil. Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).
- Connell, L., et al. Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica. Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).
- Vishniac, H. S. A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient. Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).
- Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. . The Yeasts: A Taxonomic Study. , (2011).
- Samarasinghe, H., et al. Global patterns in culturable soil yeast diversity. iScience. 24 (10), 103098 (2021).
- Xu, J. Fungal DNA barcoding. Genome. 59 (11), 913-932 (2016).
- Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils. FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).
- Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).
- Xu, J. Fungal species concepts in the genomics era. Genome. 63 (9), 459-468 (2020).
- Brakhage, A. A., Langfelder, K. Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus. Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
- Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).
- Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate. Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).
- Chowdhary, A., et al. Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India. PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen. PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).
- Sewell, T. R., et al. Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus. mBio. 10 (3), 00392 (2019).
- Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus. mSphere. 2 (1), 00019 (2017).
- Heo, S. T., et al. Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015. Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).
- de Valk, H. A., et al. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates. Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).
- Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes. Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).
- Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process. Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).
- Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. Isolation and characterization of mutations in the Β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae. 유전학. 111 (4), 715-734 (1985).
- Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans. Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).
- Paoletti, M., et al. Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).
- De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).
- Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting linear mixed-effects models using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
- Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. BLAST ® Command Line Applications User Manual. National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).
- Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon. Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).
- Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils. Genes. 13 (1), 19 (2021).
- Snelders, E., et al. Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles. Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).
- Wang, H. -. C., et al. mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan. Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).
