Изоляция и мультиплексирование ядра со штрихкодированными антителами симпатических ганглиев мыши для секвенирования одноядерной РНК
Summary
Этот протокол описывает подробную, низковходную пробоподготовку для секвенирования с одним ядром, включая рассечение верхних цервикальных и звездчатых ганглиев мыши, диссоциацию клеток, криоконсервацию, выделение ядра и штрих-кодирование хэштегов.
Abstract
Сердечная вегетативная нервная система имеет решающее значение для контроля сердечной функции, такой как частота сердечных сокращений и сократимость сердца, и делится на симпатическую и парасимпатическую ветви. Как правило, существует баланс между этими двумя ветвями для поддержания гомеостаза. Однако состояния сердечных заболеваний, такие как инфаркт миокарда, сердечная недостаточность и гипертония, могут вызывать ремоделирование клеток, участвующих в сердечной иннервации, что связано с неблагоприятным клиническим исходом.
Хотя существует огромное количество данных о гистологической структуре и функции сердечной вегетативной нервной системы, ее молекулярно-биологическая архитектура в здоровье и болезнях все еще загадочна во многих аспектах. Новые технологии, такие как секвенирование одноклеточной РНК (scRNA-seq), обещают генетическую характеристику тканей с одноклеточным разрешением. Однако относительно большой размер нейронов может препятствовать стандартизированному использованию этих методов. Здесь этот протокол использует секвенирование одноядерной РНК на основе капель (snRNA-seq), метод характеристики биологической архитектуры сердечных симпатических нейронов в здоровье и болезни. Продемонстрирован поэтапный подход для выполнения snRNA-seq двустороннего верхнего шейного (SCG) и звездчатого ганглия (StG), рассеченных у взрослых мышей.
Этот метод обеспечивает долгосрочное сохранение образцов, поддерживая адекватное качество РНК, когда образцы от нескольких людей / экспериментов не могут быть собраны все сразу в течение короткого периода времени. Штрих-кодирование ядер с помощью хэштегов oligos (HTO) позволяет демультиплексировать и отслеживать отдельные ганглионные образцы после секвенирования. Последующие анализы выявили успешный захват ядер нейрональных, спутниковых глиальных и эндотелиальных клеток симпатических ганглиев, что подтверждается snRNA-seq. Таким образом, этот протокол обеспечивает поэтапный подход к snRNA-seq симпатических внешних сердечных ганглиев, метод, который имеет потенциал для более широкого применения в исследованиях иннервации других органов и тканей.
Introduction
Вегетативная нервная система (ВНС) является важнейшей частью периферической нервной системы, которая поддерживает гомеостаз организма, включая адаптацию к условиям окружающей среды и патологии1. Он участвует в регуляции нескольких систем органов по всему телу, таких как сердечно-сосудистая, дыхательная, пищеварительная и эндокринная системы. ВНС делится на симпатическую и парасимпатическую ветви. Спинномозговые ветви симпатической нервной системы синапс в ганглиях симпатической цепи, расположенные двусторонне в паравертебральном положении. Двусторонние шейные и грудные ганглии, особенно StG, являются важными компонентами, участвующими в сердечной симпатической иннервации. При болезненных состояниях, таких как ишемия сердца, может произойти ремоделирование нейронов, что приводит к симпатическому овердрайву2. Ремоделирование нейронов было продемонстрировано в нескольких гистологических исследованиях на людях и нескольких других видах животных 3,4,5,6. Подробная биологическая характеристика ремоделирования нейронов, вызванного ишемией сердца, в сердечных симпатических ганглиях в настоящее время отсутствует, а фундаментальные биологические характеристики специализированных типов нейрональных клеток или подтипов в сердечной симпатической нервной системе (SNS) еще не полностью определены при здоровье и заболевании7.
Новые технологии, такие как scRNA-seq, открыли шлюзы для генетической характеристики мелких тканей на одноклеточном уровне 8,9. Однако относительно большой размер нейронов может препятствовать оптимизированному использованию этих одноклеточных методов у людей10. Кроме того, секвенирование одной клетки требует высокой пропускной способности клеток для восстановления достаточного количества клеток из-за высоких потерь в процессе секвенирования. Это может оказаться сложной задачей при изучении небольших тканей, которые трудно захватить за один сеанс и требуют нескольких образцов для введения достаточного количества одиночных клеток для секвенирования. Недавно разработанная технология snRNA-seq на основе капель (то есть платформа 10x Chromium) позволяет изучать биологические различия между одиночными ядрами11,12. snRNA-seq имеет преимущество перед scRNA-seq для крупных клеток (>30 мкм), которые не могут быть захвачены в Gel Bead in Emulsions (GEMs), а также улучшенную совместимость с обширной диссоциацией и/или длительным сохранением 13,14,15.
Гетерогенность, количество нейрональных клеток и других клеток, обогащенных сердечными СНС, являются важными аспектами для характеристики ВНС в состояниях здоровья и заболевания. Кроме того, органная или региональная иннервация каждым симпатическим ганглием способствует усложнению СНС. Кроме того, было показано, что шейные, звездчатые и грудные ганглии симпатической цепи иннервируют различные области сердца16. Поэтому необходимо выполнить одноядерный анализ ганглионарных клеток, полученных из отдельных ганглиев, для изучения их биологической архитектуры.
SnRNA-seq на основе капель позволяет профилировать экспрессию транскриптома для пула из тысяч клеток из нескольких образцов одновременно с более низкими затратами, чем платформы секвенирования на основе пластин. Этот подход позволяет snRNA-seq на основе капель быть более подходящим для классификации клеточного фенотипа и новой субпопуляционной идентификации клеток в SCG и StG. Примечательно, что этот протокол обеспечивает краткий поэтапный подход к идентификации, выделению и секвенированию одноядерной РНК симпатических внешних сердечных ганглиев, метод, который имеет потенциал для широкого применения в исследованиях характеристик ганглиев, иннервирующих другие связанные органы и ткани в здоровье и болезни.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь описан подробный протокол, который фокусируется на i) рассечении верхних шейных и звездчатых симпатических ганглиев взрослой мыши, ii) изоляции и криоконсервации ганглионарных клеток, iii) выделении ядра и iv) штрих-кодировании ядра с маркировкой HTO для целей мультиплексирования и snRN…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим Сьюзан Л. Клоэт (Департамент генетики человека, LUMC, Лейден, Нидерланды) за ее помощь в экспериментальном проектировании и полезных дискуссиях. Мы благодарим Emile J. de Meijer (Департамент генетики человека, LUMC, Лейден, Нидерланды) за помощь в выделении одноядерной РНК и подготовке библиотеки к секвенированию. Эта работа поддерживается Нидерландской организацией научных исследований (NWO) [016.196.346 to M.R.M.J.].
Materials
| Chemicals and reagents | |||
| 0.25% Trypsin-EDTA | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| 0.4% trypan blue dye | Bio-Rad | 1450021 | |
| Antibiotic-Antimycotic | Gibco | 15240096 | |
| B-27 | Gibco | A3582801 | |
| Collagenase type 2 | Worthington | LS004176 | use 1,400 U/mL |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma Aldrich | 67685 | |
| Ethanol absolute ≥99.5% | VWR | VWRC83813.360 | |
| Fetal bovine serum (low endotoxin) | Biowest | S1810-500 | |
| L-glutamine | Thermo Fisher Scientific | 25030024 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21103049 | |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Cell wash buffer |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Cell wash buffer |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | Nucleus Lysis buffer |
| Nonidet P40 Substitute (nonionic detergent) | Sigma-Aldrich | 74385 | Nucleus Lysis buffer |
| Nuclease free water (not DEPC-treated) | Invitrogen | AM9937 | Nucleus Lysis buffer |
| Protector RNase Inhibitor, 40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus Lysis buffer |
| Sodium Chloride Solution, 5 M | Sigma-Aldrich | 59222C | Nucleus Lysis buffer |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1 M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | Nucleus Lysis buffer |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | Nucleus wash |
| DPBS (Ca2+, Mg2+free) | Gibco | 14190-169 | Nucleus wash |
| Protector RNase Inhibitor,40 U/µL | Sigma-Aldrich | 3335399001 | Nucleus wash |
| Bovine Serum Albumin 10% | Sigma-Aldrich | A1595-50ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Calcium chloride solution, 1 M | Sigma-Aldrich | 21115-100ML | ST staining buffer (ST-SB) |
| Magnesium Chloride Solution, 1 M | Sigma-Aldrich | M1028 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Nuclease free water (not DEPC treated) | Invitrogen | AM9937 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Sodium Chloride Solution, 5M | Sigma-Aldrich | 59222C | ST staining buffer (ST-SB) |
| Trizma Hydrochloride Solution, 1M, pH 7.4 | Sigma-Aldrich | T2194 | ST staining buffer (ST-SB) |
| Tween-20 | Merck Millipore | 822184 | ST staining buffer (ST-SB) |
| TotalSeq-A0451 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 1 Antibody | Biolegend | 682205 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0452 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 2 Antibody | Biolegend | 682207 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0453 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 3 Antibody | Biolegend | 682209 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0461 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 11 Antibody | Biolegend | 682225 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0462 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 12 Antibody | Biolegend | 682227 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0463 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 13 Antibody | Biolegend | 682229 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0464 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 14 Antibody | Biolegend | 682231 | Hashtag antibody |
| TotalSeq-A0465 anti-Nuclear Pore Complex Proteins Hashtag 15 Antibody | Biolegend | 682233 | Hashtag antibody |
| TruStain FcX (human) | Biolegend | 422302 | FC receptor blocking solution |
| Equipment and consumables | |||
| Bright-Line Hemacytometer | Merck | Z359629-1EA | |
| Centrifuge 5702/R A-4-38 | Eppendorf | EP022629905 | |
| CoolCell LX Cell Freezing Container | Corning | CLS432003-1EA | |
| Cryovial | Thermo Scientific | 479-6840 | |
| DNA LoBind 0.5 mL Eppendorf tube | Eppendorf | EP0030108035-250EA | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes 1.5 mL | Eppendorf | 30121872 | |
| Falcon 35 mm Not TC-treated Petri dish | Corning | 351008 | |
| Falcon 15 mL Conical Centrifuge Tubes | Fisher scientific | 10773501 | |
| Forceps Dumont #5 | Fine science tools | 11252-40 | |
| Hardened Fine Scissors | Fine science tools | 14091-09 | |
| Ice Pan, rectangular 4 L Orange | Corning | CLS432106-1EA | |
| Leica MS5 | Leica | Microscope | |
| Moria MC50 Scissors | Fine science tools | 15370-50 | |
| Noyes Spring Scissors | Fine science tools | 15012-12 | |
| Olympus CK2 ULWCD | Olympus | Microscope | |
| P10 | Gilson | F144802 | |
| P1000 | Gilson | F123602 | |
| P200 | Gilson | F123601 | |
| Preseparation Filters (30 µm) | Miltenyi biotec | Miltenyi biotec130-041-407 | |
| Shaking water bath | GFL | 1083 | |
| Silicon plate | RubberBV | 3530 | Dissection board |
| Software and packages | |||
| Cell ranger | V4.0.0 | ||
| R programming | V4.1.1 | ||
| R sudio | V1.3.1073 | ||
| Seurat | V4.0 | ||
| tydiverse | V1.3.1 | ||
| Animals | |||
| B6.Cg-Tg(Wnt1-cre)2Sor/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #022501 | |
| B6.129(Cg)-Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J mouse | The Jackson Laboratory | JAX stock #007576 | |
| C57BL/6J mice | Charles River | ||
| Code for the data analysis | |||
| https://github.com/rubenmethorst/Single-cell-SCG_JoVE |
References
- McCorry, L. K. Physiology of the autonomic nervous system. American Journal of Pharmaceutical Education. 71 (4), 78 (2007).
- Li, C. -. Y., Li, Y. -. G. Cardiac sympathetic nerve sprouting and susceptibility to ventricular arrhythmias after myocardial infarction. Cardiology Research and Practice. 2015, 698368 (2015).
- Ajijola, O. A., et al. Extracardiac neural remodeling in humans with cardiomyopathy. Circulation: Arrhythmia and Electrophysiology. 5 (5), 1010 (2012).
- Nguyen, B. L., et al. Acute myocardial infarction induces bilateral stellate ganglia neural remodeling in rabbits. Cardiovascular Pathology. 21 (3), 143-148 (2012).
- Ajijola, O. A., et al. Remodeling of stellate ganglion neurons after spatially targeted myocardial infarction: Neuropeptide and morphologic changes. Heart Rhythm. 12 (5), 1027-1035 (2015).
- Han, S., et al. Electroanatomic remodeling of the left stellate ganglion after myocardial infarction. Journals of the American College of Cardiology. 59 (10), 954-961 (2012).
- Zeisel, A., et al. Molecular architecture of the mouse nervous system. Cell. 174 (4), 999-1014 (2018).
- Svensson, V., Vento-Tormo, R., Teichmann, S. A. Exponential scaling of single-cell RNA-seq in the past decade. Nature Protocols. 13 (4), 599-604 (2018).
- Li, C. L., et al. Somatosensory neuron types identified by high-coverage single-cell RNA-sequencing and functional heterogeneity. Cell Research. 26 (8), 967 (2016).
- Kokubun, S., et al. Distribution of TRPV1 and TRPV2 in the human stellate ganglion and spinal cord. Neuroscience Letters. 590, 6-11 (2015).
- Lake, B. B., et al. A single-nucleus RNA-sequencing pipeline to decipher the molecular anatomy and pathophysiology of human kidneys. Nature Communication. 10 (1), 2832 (2019).
- Petrany, M. J., et al. Single-nucleus RNA-seq identifies transcriptional heterogeneity in multinucleated skeletal myofibers. Nature Communication. 11 (1), 6374 (2020).
- Wu, H., Kirita, Y., Donnelly, E. L., Humphreys, B. D. Advantages of single-nucleus over single-cell RNA sequencing of adult kidney: rare cell types and novel cell states revealed in fibrosis. Journal of the American Society of Nephrology. 30 (1), 23-32 (2019).
- Bakken, T. E., et al. Single-nucleus and single-cell transcriptomes compared in matched cortical cell types. PLoS One. 13 (12), 0209648 (2018).
- Gaublomme, J. T., et al. Nuclei multiplexing with barcoded antibodies for single-nucleus genomics. Nature Communications. 10 (1), 2907 (2019).
- Zandstra, T. E., et al. Asymmetry and heterogeneity: part and parcel in cardiac autonomic innervation and function. Frontiers in Physiology. 12, 665298 (2021).
- Lewis, A. E., Vasudevan, H. N., O’Neill, A. K., Soriano, P., Bush, J. O. The widely used Wnt1-Cre transgene causes developmental phenotypes by ectopic activation of Wnt signaling. 발생학. 379 (2), 229-234 (2013).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Stuart, T., et al. Comprehensive integration of single cell data. bioRxiv. , (2018).
- Avraham, O., et al. Satellite glial cells promote regenerative growth in sensory neurons. Nature Communications. 11 (1), 4891 (2020).
- Stoeckius, M., et al. Cell Hashing with barcoded antibodies enables multiplexing and doublet detection for single cell genomics. Genome Biology. 19 (1), 224 (2018).
- Lacar, B., et al. Nuclear RNA-seq of single neurons reveals molecular signatures of activation. Nature Communications. 7 (1), 11022 (2016).
- Lake, B. B., et al. A comparative strategy for single-nucleus and single-cell transcriptomes confirms accuracy in predicted cell-type expression from nuclear RNA. Scientific Reports. 7 (1), 6031 (2017).
- Grindberg, R. V., et al. RNA-sequencing from single nuclei. Proceedings of the National Academy of Sciences. 110 (49), 19802-19807 (2013).
