Summary
Протокол описывает модификацию быстрого метода Гольджи, который может быть адаптирован к любой части нервной системы, для окрашивания нейронов в гиппокампе и медиальной префронтальной коре крысы.
Abstract
Пропитка Гольджи с использованием набора окрашивания Гольджи с незначительными адаптациями используется для пропитки дендритных шипов в гиппокампе крыс и медиальной префронтальной коре. Этот метод является заметным улучшением по сравнению с предыдущими методами пропитки Гольджи, потому что предварительно смешанные химические вещества безопаснее в использовании, нейроны последовательно хорошо пропитываются, существует гораздо меньше фонового мусора, а для данной области существуют чрезвычайно небольшие отклонения в плотности позвоночника между экспериментами. Более того, мозг может накапливаться после определенного момента и храниться замороженным до дальнейшей обработки. С помощью этого метода можно изучить любую область мозга, представляющую интерес. После окрашивания и проскальзывания покрытия плотность дендритного позвоночника определяется путем подсчета количества шипов на длину дендрита и выражается в виде плотности позвоночника на 10 мкм дендрита.
Introduction
Метод использования дихромата калия и нитрата серебра для маркировки нейронов был впервые описан Камилло Гольджи 1,2 и впоследствии использован Сантьяго Рамоном-и-Кахалем для получения огромного объема работы, дифференцирующей нейронные и глиальные подтипы. Недавно опубликованная книга с его иллюстрациями теперь доступна3. После исследований Рамона-и-Кахала, которые были опубликованы более 100 лет назад, было использовано очень мало пропитки Гольджи. Пропитка Гольджи – это трудоемкий процесс, позволяющий осуществлять трехмерную визуализацию нейронов с помощью светового микроскопа. На протяжении многих лет было проведено множество модификаций метода Гольджи, чтобы сделать метод проще, а окрашивание более последовательным4. В 1984 году Габботт и Somogyi5 описали процедуру пропитки Гольджи с одним участком, которая позволила ускорить обработку. Этот метод пропитки Гольджи требует перфузии 4% параформальдегида и 1,5% пикриновой кислоты, постфиксации с последующим разделением вибратома в ванну с 3% дихромата калия. Секции крепятся на стеклянные горки, четыре угла обшивки приклеиваются так, чтобы при погружении в нитрат серебра диффузия происходила постепенно. Затем крышки отрываются, секции обезвоживаются, и в конечном итоге крышка постоянно скользит с монтажной средой. Этот метод был успешно использован для маркировки нейронов и глии 6,7,8 в гиппокампе. Быстрый метод Гольджи, описанный здесь, является улучшением, потому что существует гораздо меньшее воздействие как дихромата калия, так и нитрата серебра, и не используются параформальдегид и пикриновая кислота. Кроме того, хотя клетки, которые были пропитаны с использованием модификаций метода Габботта и Сомогьи5, могли быть проанализированы, часто участки подвергались чрезмерному или недостаточному воздействию или падали с слайдов на стадии обезвоживания, и, как правило, несколько экспериментов должны были быть объединены, чтобы иметь достаточное количество клеток для анализа.
Настоящий протокол описывает использование набора окрашивания Гольджи (см. Таблицу материалов) для маркировки дендритов и дендритных шипов в гиппокампе и медиальной префронтальной коре (mPFC) крысы. Преимущества этого метода перед предыдущими заключаются в том, что он быстрый, для исследователя меньше воздействия вредных химических веществ и происходит последовательное окрашивание нейронов. Протокол, описанный ниже, использовался с незначительными изменениями для оценки плотности дендритного позвоночника в гиппокампе и mPFC крысы во многих исследованиях 9,10,11,12,13,14,15.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Все экспериментальные процедуры одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию Университета Святого Сердца и соответствуют Руководству NIH по уходу за животными и их использованию.
1. Выделение и инфильтрация мозговой ткани
- Растворы премиксов А и В окрашивающего набора Golgi за 24 ч до использования и хранить в темных флаконах и/или в темноте. Внесите приблизительно 80 мл смеси раствора А и В, что достаточно для замены раствора через 24 ч. Хранить в герметичных бутылках.
ПРИМЕЧАНИЕ: Перфузия физиологическим раствором или параформальдегидом не требуется. - Приносят в жертву крыс на гильотине после эвтаназии углекислого газа и удаляют мозг в течение нескольких секунд. Промывайте мозг физиологическим раствором, если это необходимо, но не обязательно.
- Поместите мозг, кору вниз так, чтобы гипоталамус был виден, потому что разрезы сделаны спереди и сзади к нему, на непористой поверхности. Разрезать на передний (содержит префронтальную кору) и задний (содержит гиппокамп) блок, как показано на рисунке 1.
- Поместите блоки в предварительно смешанные растворы А и В, убедившись, что они хорошо погружены в раствор. Убедитесь, что объем растворов А и В достаточен для погружения блоков. Храните блоки в коричневых бутылках или прозрачных бутылках, покрытых фольгой (чтобы не было света) в темноте при комнатной температуре.
- Заменить раствор через 24 ч и держать в темноте еще 13 дней при комнатной температуре.
ПРИМЕЧАНИЕ: При использовании с мозгом мыши нет необходимости блокировать, и весь мозг может быть помещен в раствор. При окрашивании участков мозга, которые отличаются по размеру, время в растворах А и В, возможно, придется определять методом проб и ошибок. - Через две недели ткани хорошо инфильтрируют растворами А и В, переносят блоки в раствор криопротектора (раствор С в наборе для окрашивания Гольджи) и оставляют их на 48-72 ч при 4 °С.
ПРИМЕЧАНИЕ: После криозащиты блоки могут быть заморожены до дальнейшей обработки. Также обратите внимание, что все растворы из комплекта собираются и утилизируются как опасные отходы. - Заморозьте мозг, кору вниз, на стеклянной горке по сухому льду. После замораживания либо нарезать на криостате, либо хранить при -80 °C до секционирования с помощью криостата.
ПРИМЕЧАНИЕ: Не замораживайте в жидком азоте, так как это создает трещины в ткани.
2. Разрезание тканей головного мозга
- Поместите небольшое количество тканевой среды на предварительно охлажденный криостатный патрон. Установите блоки на криостатные патроны, слегка разморозив одну сторону блока в руке (в перчатке) и поместив его на тканевую среду.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости встраивать ткань. Блок, содержащий гиппокамп, несколько легче разрезать, чем блок с префронтальной корой, потому что последняя находится перед мозолистым телом, а две половины разделены. - Вырежьте секции по 100 мкм на криостате при -22 °C и установите их на подкладные слайды. Могут использоваться секции толщиной до 150 мкм. Попробуйте смонтировать 3-4 корональных сечения на слайд, так как это уменьшает количество слайдов, требующих обработки. Используйте один из следующих методов, чтобы держать секции замороженными, пока они не попадут на слайд.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эти секции не фиксируются обычным способом, и поэтому они имеют тенденцию быстро плавиться. Дайте секциям расплавиться на слайде. Если они начинают плавиться до того, как их укладывают на горку, невозможно заставить их быть плоскими на горке. Для этого существует несколько методик.- Используйте замораживающий спрей на ноже и блоке. В зависимости от температуры и влажности в помещении это может понадобиться для каждой секции. Используйте либо противооткатную пластину, либо кисть, чтобы сохранить секцию плоской во время резки.
ПРИМЕЧАНИЕ: Убедитесь, что у вас достаточно морозильного спрея. Несколько банок можно использовать при резке 20 блоков. - Оттаивайте крепление, если это возможно, с помощью горки комнатной температуры и быстро прикрепите ее к секции. С практикой можно монтировать сразу несколько секций. Если это не сработает, держите слайды в криостате, чтобы они были очень холодными, и перенесите секцию холодными щипцами или холодной кистью, а затем оттаивайте.
- Используйте замораживающий спрей на ноже и блоке. В зависимости от температуры и влажности в помещении это может понадобиться для каждой секции. Используйте либо противооткатную пластину, либо кисть, чтобы сохранить секцию плоской во время резки.
- Очистите нож бумажными салфетками между срезами. Если нож требует дополнительной очистки, используйте 100% этанол (EtOH) и дайте ему высохнуть, прежде чем нарезать следующий ломтик.
- После установки на горку поместите слайд на картонные лотки и дайте секциям высохнуть при комнатной температуре (в течение нескольких часов до максимум 48 часов) в темноте. Не закрывайте лоток для слайдов. Убедитесь, что секции полностью высохли перед пропиткой Гольджи. Хранить плоско, в темноте, на подносах до пропитки Гольджи.
ПРИМЕЧАНИЕ: Высыхание секций не наносит никаких повреждений.
3. Окрашивание и обезвоживание мозговой ткани
- Выполняют окрашивание в стеклянную витражную посуду. Смешайте растворы D и E непосредственно перед окрашиванием. В соответствии с протоколом, добавьте одну часть раствора D, одну часть раствора E и две части дистиллированной воды. Для стеклянных витражей посуды сделайте раствор объемом 200 мл, чтобы полностью погрузить секции. Для банок Коплина это требует меньшего объема.
- Разместите слайды в стойках, расположенных достаточно далеко друг от друга, чтобы обеспечить доступ решения к секциям.
- Поместите секции в дистиллированную воду на 4 мин (2x), прежде чем поместить их в раствор для окрашивания Golgi в течение 10 мин. Меняйте окрашивающий раствор каждые 70 секций. Меняйте дистиллированную воду, когда она пожелтеет.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время для этапа окрашивания имеет решающее значение. Слишком короткий не допускает достаточного окрашивания и слишком длинный вызывает чрезмерное окрашивание, что затрудняет разделение дендритов при проведении анализа. После выхода из окрашивающего раствора сроки менее критичны. - Обезвоживать срезы следующим образом: 70% EtOH (5 мин), 95% EtOH (5 мин; 2x), 100% EtOH (5 мин; 2x), очищающее средство (5 мин; 3x). Часто меняйте все растворы, особенно 100% EtOH и очищающий агент, чтобы гарантировать, что секции остаются безводными.
ПРИМЕЧАНИЕ: Нет необходимости проходить 50% шаг EtOH. Контрокрашивание не требуется для визуализации клеток, поскольку пропитка Гольджи обеспечивает достаточную контрастность. Использование других клиринговых агентов не сработало так же хорошо, как то, которое используется здесь (см. Таблицу материалов). - Обшивка со стеклянными обшивками длиной 60 мм с большим количеством монтажной среды. Убедитесь, что там, как можно меньше пузырьков воздуха. При необходимости аккуратно снимите и переделайте крышку (можно сделать даже через несколько недель). Делайте это очень медленно, чтобы не повредить секцию (можно сделать из-за большого количества монтажной среды).
ПРИМЕЧАНИЕ: Большое количество монтажной среды несколько грязно, но все же необходимо, потому что для покрытия толстых секций 100 мкм необходимо использовать достаточно монтажной среды. - Чтобы убедиться, что на секциях размещен только один обшивочный лист, отделите обшивки до начала процесса.
- После того, как крышка соскользнула, сухие горки плоские на любой непористой бумаге в течение 3-5 дней, слегка перемещая их, особенно после первого дня, чтобы избежать прилипания. Через 3-5 дней перенесите горки в держатели для слайдов и, в идеале, высушите горки не менее чем на 3 недели перед их осмотром. Держите горки плоскими, чтобы уменьшить вероятность образования пузырьков воздуха.
4. Определение плотности дендритного отдела позвоночника
- Для анализа плотности дендритного позвоночника в пирамидальных нейронах как mPFC, так и области CA1 гиппокампа исследуйте наиболее боковые вторичные базальные дендриты и наиболее боковые третичные апикальные дендриты, как описано на этапе 4.1.1 (Рисунок 2).
- Выберите дендрит, измерьте длину дендрита с помощью программы анализа изображений, подсчитайте шипы на дендритах с помощью счетчика рук и запишите как длину, так и количество шипов.
- Изучите и проанализируйте шесть клеток на область (mPFC, CA1) на мозг. Количественно оцените минимум шесть мозгов на группу, как описано ранее 7,8. Выбирайте нейроны, которые соответствуют следующим критериям анализа: клеточные тела и дендриты хорошо пропитаны; дендриты различимы от соседних клеток и являются непрерывными.
- Подсчитайте шипы в 1000x (погружение в масло) с помощью ручного счета с помощью светового микроскопа и измерьте длину дендрита с помощью программы анализа изображений. Рассчитайте плотность позвоночника, разделив число позвоночника на длину дендрита и выразите данные как количество шипов / 10 мкм дендрита.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют гораздо более сложные методы дифференциации подтипов позвоночника и дендритной архитектуры, которые могут быть использованы, но ручной подсчет с помощью светового микроскопа в 1000x может дать быстрый результат, который затем может определить, необходимо ли дальнейшее исследование. Хотя прилагаются все усилия для последовательного отбора образцов похожих дендритов, существуют различия в толщине, которые могут повлиять на подсчет.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Используя быстрый метод Гольджи, клетки последовательно хорошо пропитываются, так что есть много клеток для анализа. Это заметное улучшение по сравнению с предыдущими методами, где эксперименты должны были быть объединены, чтобы иметь достаточно данных для анализа. Таким образом, больше образцов может быть обработано одновременно, а мозг может храниться замороженным до обработки. Примеры пропитанных Гольджи клеток в области CA1 гиппокампа показаны с низкой и высокой мощностью на рисунке 3. Подсчет шипов в данной области дает последовательные результаты с небольшими стандартными ошибками. Это важно еще и потому, что можно проводить сравнения между экспериментами. Рисунок 4 иллюстрирует эксперимент, в котором базальная плотность дендритного позвоночника была увеличена на пирамидальных клетках у самцов и самок крыс-подростков после обогащения окружающей среды (ЭЭ) как в CA1, так и в mPFC. Короче говоря, самцов и самок крыс отлучали от груди в послеродовой день (PND) 21 и относили к контрольным или обогащенным группам. Группа ЭЭ проводила 2 ч/сут в обогащенном корпусе из ПНД 24-42, в то время как контрольная группа была размещена в обычных клетках в течение этого времени. ЭЭ индуцировала у подростков обоих полов увеличение базальной дендритной плотности позвоночника как в CA1, так и в mPFC. Обратите внимание на небольшую стандартную погрешность среднего значения (SEM) во всех значениях дендритного отдела позвоночника.
Рисунок 1: Вентральная поверхность мозга крысы. Фотография вентральной поверхности мозга свежей крысы, указывающая, где разрезать на передний и задний блоки перед погружением блоков в исходные растворы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Типичная пирамидальная клетка. Схема пирамидальной клетки, иллюстрирующая апикальные и базальные дендриты, которые анализируются на дендритную плотность позвоночника. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: Пропитанный Гольджи нейрон. Примеры пропитанных Гольджи нейронов в области CA1 гиппокампа крысы. Слева: несколько пропитанных пирамидальных клеток. Шкала шкалы = 25 мкм. Вверху справа: Базальные дендриты. Шкала = 12,5 мкм. Внизу справа: Пример вторичного базального дендрита. Стрелки обозначают шипы. Шкала = 5 мкм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 4: Плотность позвоночника. Набор данных, иллюстрирующий базальную и апикальную плотность дендритного позвоночника в области mPFC и CA1 гиппокампа (CA1) после обогащения окружающей среды (EE) по сравнению с контролем (CON) у самцов (M) и самок крыс (F). Гистограммы показывают среднее количество шипов/10 мкм дендрита + SEM. Данные анализировались с помощью программного обеспечения статистического анализа (см. Таблицу материалов). Двусторонние (половые X EE) ANOVA использовались для тестирования групповых различий, а тесты Фишера на ЛСД использовались для пост-специального анализа. Значительными эффектами являются p<0,05. t обозначает существенную разницу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Настоящий протокол описывает метод пропитки Гольджи, позволяющий быстро одновременно обрабатывать многие срезы. Это улучшение по сравнению с ранее описанными5 более трудоемкими методами и последовательно дает пропитанные нейроны для анализа. Кроме того, существует меньшее воздействие токсичных химических веществ, используемых при пропитке Гольджи. Наиболее сложной частью процесса является то, чтобы секции были плоскими на слайдах, что требует значительной практики. Важно держать все как можно холоднее с использованием морозильного спрея.
После того, как слайды высохнут и можно провести анализ, очень важно быть последовательным в выборе клеток, которые подсчитываются. Пирамидальные клетки гиппокампа выбираются из CA1. Для mPFC, который имеет несколько подчастей, используются пирамидальные клетки из инфралимбической коры. По причинам, которые не ясны, окрашивается меньше клеток в mPFC, чем в области CA1 гиппокампа. Кроме того, можно комбинировать эксперименты, когда все секции не могут быть обработаны вместе по логистическим причинам. Для согласованности один и тот же человек должен считать заданный набор клеток.
Ограничения этого метода аналогичны всем методам пропитки Гольджи. Тот факт, что окрашивается только небольшое количество клеток, является преимуществом. Небольшое количество пропитанных ячеек позволяет визуализировать всю ячейку в трех измерениях. Недостатком метода Гольджи является то, что неясно, какое подмножество клеток помечено. Поэтому в экспериментах следует предположить, что клетки, пропитанные как для контрольной, так и для экспериментальной групп, одинаковы. Несмотря на то, что этот метод приводит к гораздо лучшему окрашиванию, чем предыдущие методы, всегда есть клетки, которые не могут быть проанализированы, потому что они покрыты мусором, воздушным пузырьком или сломали дендриты.
В заключение, быстрый метод Гольджи, описанный здесь, является быстрым, безопасным методом последовательной и воспроизводимой маркировки нейронов, который может быть использован для любой области мозга. В дополнение к маркировке клеток в префронтальной коре 17,18 и гиппокампе 10,12,19, он также использовался в миндалине 20, мозжечке21 и коре22. Предполагая, что человек знаком с анатомией и может быстро идентифицировать клетки, подсчет плотности позвоночника может дать быстрый результат, но он не дает информации о дендритных подтипах, что требует более сложных методов анализа.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам нечего раскрывать.
Acknowledgments
Эта работа была поддержана Исследовательской инициативой студентов Университета Святого СердцаGrants.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Cardboard slides trays | Fisher Scientific | 12-587-10 | |
| Coverslips 24 x 60mm | Fisher Scientific | 12-545-M | |
| FD Rapid GolgiStain kit | FD Neurotechnologies | PK 401 | Stable at RT in the dark for months; Golgi staining kit |
| Freezing Spray | Fisher Scientific | 23-022524 | |
| HISTO-CLEAR | Fisher Scientific | 50-899-90147 | clearing agent |
| NCSS Software | Kaysville, UT, USA | ||
| Permount | Fisher Scientific | SP-15-100 | mounting medium |
| Superfrost Plus Microscope slides | Fisher Scientific | 12-550-15 | |
| Tissue Tek CTYO OCT Compound | Fisher Scientific | 14-373-65 | Used to mount brains on cryostat chuck |
References
- Pannese, E. The Golgi Stain: invention, diffusion and impact on neurosciences. Journal of the History of the Neurosciences. 8 (2), 132-140 (1999).
- Bentivoglio, M., et al. The Original Histological Slides of Camillo Golgi and His Discoveries on Neuronal Structure. Frontiers in Neuroanatomy. 13, 3 (2019).
- Swanson, L. W., Newman, E., Araque, A., Dubinsky, J. M. The Beautiful Brain: The Drawings of Santiago Ramon y Cajal. , Abrams. 208 (2017).
- Dall'Oglio, A., Ferme, D., Brusco, J., Moreira, J. E., Rasia-Filho, A. A. The "single-section" Golgi method adapted for formalin-fixed human brain and light microscopy. Journal of Neuroscience Methods. 189 (1), 51-55 (2010).
- Gabbott, P. L., Somogyi, J. The 'single' section Golgi-impregnation procedure: methodological description. Journal of Neuroscience Methods. 11 (4), 221-230 (1984).
- Gould, E., Frankfurt, M., Westlind-Danielsson, A., McEwen, B. S. Developing forebrain astrocytes are sensitive to thyroid hormone. Glia. 3 (4), 283-292 (1990).
- Gould, E., Woolley, C. S., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Gonadal steroids regulate dendritic spine density in hippocampal pyramidal cells in adulthood. Journal of Neuroscience. 10 (4), 1286-1291 (1990).
- Woolley, C. S., Gould, E., Frankfurt, M., McEwen, B. S. Naturally occurring fluctuation in dendritic spine density on adult hippocampal pyramidal neurons. Journal of Neuroscience. 10 (12), 4035-4039 (1990).
- Frankfurt, M., Salas-Ramirez, K., Friedman, E., Luine, V. Cocaine alters dendritic spine density in cortical and subcortical brain regions of the postpartum and virgin female rat. Synapse. 65 (9), 955-961 (2011).
- Frankfurt, M., Luine, V. The evolving role of dendritic spines and memory: Interaction(s) with estradiol. Hormones Behavior. 74, 28-36 (2015).
- Bowman, R. E., Luine, V., Khandaker, H., Villafane, J. J., Frankfurt, M. Adolescent bisphenol-A exposure decreases dendritic spine density: role of sex and age. Synapse. 68 (11), 498-507 (2014).
- Bowman, R. E., et al. Bisphenol-A exposure during adolescence leads to enduring alterations in cognition and dendritic spine density in adult male and female rats. Hormones Behavior. 69, 89-97 (2015).
- Eilam-Stock, T., Serrano, P., Frankfurt, M., Luine, V. Bisphenol-A impairs memory and reduces dendritic spine density in adult male rats. Behavioral Neuroscience. 126 (1), 175-185 (2012).
- Inagaki, T., Frankfurt, M., Luine, V. Estrogen-induced memory enhancements are blocked by acute bisphenol A in adult female rats: role of dendritic spines. Endocrinology. 153 (7), 3357-3367 (2012).
- Jacome, L. F., et al. Gonadal Hormones Rapidly Enhance Spatial Memory and Increase Hippocampal Spine Density in Male Rats. Endocrinology. 157 (4), 1357-1362 (2016).
- Frankfurt, M. Bisphenol-A: a plastic manufacturing compound disrupts critical brain structures and impairs memory. Research Features. , https://researchfeatures.com/wp-content/uploads/2021/05/Maya-Frankfurt.pdf (2021).
- Wallace, M., Luine, V., Arellanos, A., Frankfurt, M. Ovariectomized rats show decreased recognition memory and spine density in the hippocampus and prefrontal cortex. Brain Research. 1126 (1), 176-182 (2006).
- Wallace, M., Frankfurt, M., Arellanos, A., Inagaki, T., Luine, V. Impaired recognition memory and decreased prefrontal cortex spine density in aged female rats. Annals of the New York Academy of Science. 1097, 54-57 (2007).
- Bowman, R. E., Hagedorn, J., Madden, E., Frankfurt, M. Effects of adolescent Bisphenol-A exposure on memory and spine density in ovariectomized female rats: Adolescence vs adulthood. Hormones Behavior. 107, 26-34 (2019).
- Novaes, L. S., Dos Santos, N. B., Perfetto, J. G., Goosens, K. A. Environmental enrichment prevents acute restraint stress-induced anxiety-related behavior but not changes in basolateral amygdala spine density. Psychoneuroendocrinology. 98, 6-10 (2018).
- Trzesniewski, J., Altmann, S., Jäger, L., Kapfhammer, J. P. Reduced Purkinje cell size is compatible with near normal morphology and function of the cerebellar cortex in a mouse model of spinocerebellar ataxia. Experimental Neurology. 311, 205-212 (2019).
- Zemmar, A., et al. Oligodendrocyte- and Neuron-Specific Nogo-A Restrict Dendritic Branching and Spine Density in the Adult Mouse Motor Cortex. Cerebral Cortex. 28 (6), 2109-2117 (2018).
