الخلايا الظهارية الأنفية البشرية الأولية: البنوك الحيوية في سياق الطب الدقيق
Summary
هنا نصف عزل وتضخيم وتمايز الخلايا الظهارية الأنفية البشرية الأولية (HNE) في واجهة الهواء السائل وبروتوكول البنوك الحيوية الذي يسمح بتجميد ومن ثم إذابة HNE المضخمة بنجاح. يحلل البروتوكول الخصائص الكهروفسيولوجية لخلايا HNE المتباينة وتصحيح إفراز الكلوريد المرتبط ب CFTR على علاجات معدلة مختلفة.
Abstract
من السهل جمع الخلايا الظهارية الأنفية البشرية (HNE) عن طريق تنظيف الأنف بالفرشاة البسيطة وغير الغازية. يمكن تضخيم خلايا HNE الأولية المشتقة من المريض وتمييزها إلى ظهارة طبقية زائفة في ظروف الواجهة الهوائية السائلة لتحديد كمية نقل الكلوريد الدوري بوساطة AMP (Cl–) كمؤشر لوظيفة منظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي (CFTR). إذا تم تنفيذ الخطوات الحاسمة مثل جودة تنظيف الأنف بالفرشاة وكثافة الخلايا عند الحفظ بالتبريد بكفاءة ، فيمكن إجراء خلايا HNE بنجاح في البنوك الحيوية. علاوة على ذلك، تظهر دراسات تيار الدائرة القصيرة أن ذوبان الجليد لا يعدل بشكل كبير الخصائص الكهروفسيولوجية لخلايا HNE واستجابتها لمعدلات CFTR. في ظروف الثقافة المستخدمة في هذه الدراسة ، عندما يتم تجميد أقل من 2 × 106 خلايا لكل تبريد ، يكون معدل الفشل مرتفعا جدا. نوصي بتجميد ما لا يقل عن 3 × 106 خلايا لكل تبريد. لقد أظهرنا أن العلاجات المزدوجة التي تجمع بين مصحح CFTR و CFTR المقوي لها فعالية تصحيح مماثلة لنشاط CFTR في خلايا HNE F508del-homozygous. العلاج الثلاثي VX-445 + VX-661 + VX-770 زاد بشكل كبير من تصحيح نشاط CFTR مقارنة بالعلاج المزدوج VX-809 + VX-770. يعد مقياس نشاط CFTR في خلايا HNE مؤشرا حيويا واعدا قبل السريرية مفيدا لتوجيه العلاج بمغير CFTR.
Introduction
التليف الكيسي (CF) هو اضطراب صبغي جسدي متنحي ناتج عن طفرات في جين منظم التوصيل عبر الغشاء للتليف الكيسي (CFTR) مما يؤدي إلى غياب أو خلل وظيفي في بروتين CFTR ، وهي قناة أنيون تقع على السطح القمي للظهارة 1,2. أدت التطورات الحديثة في علاج CFTR إلى تحسين تشخيص المرض ، وأدت آخر الأدوية المعتمدة التي تجمع بين مصححات CFTR ومحفزات CFTR إلى تحسينات كبيرة في وظائف الرئة ونوعية الحياة لمرضى CF الذين يحملون الطفرة الأكثر شيوعا p.Phe508del طفرة (F508del)3,4. على الرغم من هذا التقدم العلاجي الواعد ، فإن حوالي 10٪ من مرضى التليف الكيسي غير مؤهلين لأنهم يحملون طفرات لا يمكن إنقاذها بواسطة معدلات CFTR هذه. بالنسبة لهؤلاء المرضى ، هناك حاجة لاختبار أدوية أخرى أو مجموعات أدوية للعثور على التركيبة الأكثر كفاءة لطفرات محددة ، مما يسلط الضوء على أهمية العلاجات الشخصية.
من السهل جمع الخلايا الظهارية الأنفية البشرية (HNE) عن طريق تنظيف الأنف بالفرشاة البسيطة وغير الغازية وتسمح بتحديد كمية انتقال الكلوريد الدوري بوساطة AMP (Cl−) كمؤشر لوظيفة CFTR. تنتج خلايا HNE نموذجا دقيقا للمجرى الهوائي البشري ، لكن عمرها محدود في الثقافة. بفضل تحسين تقنيات الاستزراع، يمكن إعادة برمجة خلايا HNE الأولية المشتقة من المريض بشكل مشروط باستخدام مثبط كيناز المرتبط ب Rho (ROCKi)، وتضخيمها، وتمييزها إلى ظهارة طبقية زائفة في ظروف الواجهة البينية السائلة الهوائية (ALI) على المرشحات المسامية الدقيقة 5,6. توجد العديد من بروتوكولات الاستزراع لزراعة HNE (متاحة تجاريا ، خالية من المصل ، “محلية الصنع” ، زراعة مشتركة مع الخلايا المغذية ، وما إلى ذلك) ، وقد تم وصف اختيار الوسائط وظروف الثقافة للتأثير على النمو ، وتمايز عدد الخلايا والوظيفة الظهارية 7,8. يقدم البروتوكول هنا طريقة تضخيم ROCKi مبسطة وخالية من وحدة التغذية تسمح بالحصول بنجاح على عدد كبير من خلايا HNE التي يتم تمييزها بعد ذلك في ALI لفحوصات وظيفة CFTR.
لقد أثبتنا أنه في خلايا HNE المتباينة ، يكفي العلاج لمدة 48 ساعة باستخدام معدلات CFTR للحث على التصحيح الكهروفسيولوجي لتيار Cl– الحالي المعتمد على CFTR وأن التصحيح الذي لوحظ في المختبر قد يكون مرتبطا بالتحسن السريري للمريض9. وبالتالي ، تمثل خلايا HNE نموذجا مناسبا ليس فقط لأبحاث CF الأساسية ولكن للدراسات قبل السريرية مع اختبار معدل CFTR الخاص بالمريض. في هذا السياق من العلاج الشخصي ، كان الهدف من البروتوكول هو التحقق من أن خلايا HNE المحفوظة بالتجميد من مرضى التليف الكيسي ، والتي نمت في ظروفنا ، كانت نموذجا مناسبا لدراسات تصحيح CFTR ، ويمكن توقع نتائج مماثلة عند مقارنة نقل Cl المعتمد على CFTR من الخلايا الطازجة والمجمدة المذابة. كما قيمت الدراسة فعالية مختلف معدلات CFTR عند استخدام العلاجات المزدوجة والثلاثية.
Protocol
Representative Results
Discussion
تم اقتراح استخدام الخلايا الظهارية الأنفية المشتقة من المريض كبدائل للخلايا الظهارية للشعب الهوائية البشرية (HBE) لقياس نشاط CFTR في سياق الطب الشخصي حيث تقوم HNE بإعادة إنتاج خصائص الخلايا في الثقافة 9,11. الميزة القوية ل HNE على مزارع خلايا HBE هي أنه يتم أخذ عينات …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نشكر بحرارة جميع المرضى وعائلاتهم على المشاركة في الدراسة. وقد تم دعم هذا العمل من خلال منح من الرابطة الفرنسية Vaincre la Mucoviscidose. الجمعية الفرنسية ABCF 2 وجوائز فيرتكس للابتكار في مجال الأدوية.
Materials
| ABBV-2222 | Selleckchem | S8535 | |
| ABBV-974 | Selleckchem | S8698 | |
| Advanced DMEM/F-12 | Life Technologies | 12634010 | |
| Alexa 488 goat secondary antibody | Invitrogen | A11001 | |
| Alexa 594 goat secondary antibody | Invitrogen | A11012 | |
| Amphotericin B | Life Technologies | 15290026 | |
| Anti-alpha-tubulin antibody | Abcam | ab80779 | |
| Anti-CFTR monoclonal antibody (24-1) | R&D Systems | MAB25031 | |
| Anti-cytokeratin 8 antibody | Progen | 61038 | |
| Anti-Muc5AC antibody | Santa Cruz Biotech | sc-20118 | |
| Anti-ZO-1 antibody | Santa Cruz Biotech | sc-10804 | |
| Ciprofloxacin | provided by Necker Hospital Pharmacy | ||
| Colimycin | Sanofi | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Collagen type IV | Sigma-Aldrich Merck | C-7521 | |
| cytology brush | Laboratory GYNEAS | 02.104 | |
| DMSO | Sigma-Aldrich Merck | D2650 | |
| EGF | Life Technologies | PHG0311 | |
| Epinephrin | Sigma-Aldrich Merck | E4375 | |
| F12-Nutrient Mixture | Life Technologies | 11765054 | |
| FBS | Life Technologies | 10270106 | |
| Ferticult | Fertipro NV | FLUSH020 | |
| Flasks 25 | Thermo Scientific | 156.367 | |
| Flasks 75 | Thermo Scientific | 156.499 | |
| Glacial acetic acid | VWR | 20104.298 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich Merck | H3375 | |
| Hydrocortisone | Sigma-Aldrich Merck | SLCJ0893 | |
| Insulin | Sigma-Aldrich Merck | I0516 | |
| Mg2+ and Ca2+-free DPBS | Life Technologies | 14190094 | |
| Penicillin/Streptomycin | Life Technologies | 15140130 | |
| Tazocillin | Mylan | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Transwell Filters | Sigma-Aldrich Merck | CLS3470-48EA | |
| Triton-X100 | Sigma-Aldrich Merck | T8787 | |
| Trypsin 0,25% | Life Technologies | 25200056 | |
| Vectashield mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | |
| VX-445 | Selleckchem | S8851 | |
| VX-661 | Selleckchem | S7059 | |
| VX-770 | Selleckchem | S1144 | |
| VX-809 | Selleckchem | S1565 | |
| Xylocaine naphazoline 5% | Aspen France | provided by Necker Hospital Pharmacy | |
| Y-27632 | Selleckchem | S1049 |
References
- Kim, S. J., Skach, W. R. Mechanisms of CFTR folding at the endoplasmic reticulum. Frontiers in Pharmacology. 3, 201 (2012).
- Lukacs, G. L., Verkman, A. S. CFTR: folding, misfolding and correcting the ΔF508 conformational defect. Trends in Molecular Medicine. 18 (2), 81-91 (2012).
- Wainwright, C. E., et al. Lumacaftor-Ivacaftor in patients with cystic fibrosis homozygous for Phe508del CFTR. The New England Journal of Medicine. 373 (3), 220-231 (2015).
- Griese, M., et al. Safety and efficacy of elexacaftor/tezacaftor/ivacaftor for 24 weeks or longer in people with cystic fibrosis and one or more F508del alleles: Interim results of an open-label phase 3 clinical trial. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 203 (3), 381-385 (2021).
- Horani, A., Nath, A., Wasserman, M. G., Huang, T., Brody, S. L. Rho-associated protein kinase inhibition enhances airway epithelial basal-cell proliferation and lentivirus transduction. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 49 (3), 341-347 (2013).
- Liu, X., et al. Conditional reprogramming and long-term expansion of normal and tumor cells from human biospecimens. Nature Protocols. 12 (2), 439-451 (2017).
- Saint-Criq, V., et al. Choice of differentiation media significantly impacts cell lineage and response to CFTR modulators in fully differentiated primary cultures of cystic fibrosis human airway epithelial cells. Cells. 9 (9), 2137 (2020).
- Bukowy-Bieryłło, Z. Long-term differentiating primary human airway epithelial cell cultures: how far are we. Cell Communication and Signaling: CCS. 19 (1), 1-18 (2021).
- Pranke, I. M., et al. Correction of CFTR function in nasal epithelial cells from cystic fibrosis patients predicts improvement of respiratory function by CFTR modulators. Scientific Reports. 7 (1), 7375 (2017).
- Noel, S., et al. Correlating genotype with phenotype using CFTR-mediated whole-cell Cl− currents in human nasal epithelial cells. The Journal of Physiology. , (2021).
- Brewington, J. J., et al. Brushed nasal epithelial cells are a surrogate for bronchial epithelial CFTR studies. JCI Insight. 3 (13), 99385 (2018).
- Pranke, I., et al. Might brushed nasal cells be a surrogate for cftr modulator clinical response. American Journal of Respiratory and Critical Care Medicine. 199 (1), 123-126 (2019).
- de Courcey, F., et al. Development of primary human nasal epithelial cell cultures for the study of cystic fibrosis pathophysiology. American Journal of Physiology-Cell Physiology. 303 (11), 1173-1179 (2012).
- Devalia, J. L., Sapsford, R. J., Wells, C. W., Richman, P., Davies, R. J. Culture and comparison of human bronchial and nasal epithelial cells in vitro. Respiratory Medicine. 84 (4), 303-312 (1990).
- McDougall, C. M., et al. Nasal epithelial cells as surrogates for bronchial epithelial cells in airway inflammation studies. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 39 (5), 560-568 (2008).
- Mosler, K., et al. Feasibility of nasal epithelial brushing for the study of airway epithelial functions in CF infants. Journal of Cystic Fibrosis: Official Journal of the European Cystic Fibrosis Society. 7 (1), 44-53 (2008).
- Tosoni, K., Cassidy, D., Kerr, B., Land, S. C., Mehta, A. Using drugs to probe the variability of trans-epithelial airway resistance. PLOS One. 11 (2), 0149550 (2016).
- Schögler, A., et al. Characterization of pediatric cystic fibrosis airway epithelial cell cultures at the air-liquid interface obtained by non-invasive nasal cytology brush sampling. Respiratory Research. 18 (1), 215 (2017).
- Müller, L., Brighton, L. E., Carson, J. L., Fischer, W. A., Jaspers, I. Culturing of human nasal epithelial cells at the air liquid interface. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (80), e50646 (2013).
- Awatade, N. T., et al. Measurements of functional responses in human primary lung cells as a basis for personalized therapy for cystic fibrosis. EBioMedicine. 2 (2), 147-153 (2014).
- Brewington, J. J., et al. Generation of human nasal epithelial cell spheroids for individualized cystic fibrosis transmembrane conductance regulator study. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (134), e57492 (2018).
- Wiszniewski, L., et al. Long-term cultures of polarized airway epithelial cells from patients with cystic fibrosis. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 34 (1), 39-48 (2006).
- Reynolds, S. D., et al. Airway progenitor clone formation is enhanced by Y-27632-dependent changes in the transcriptome. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 55 (3), 323-336 (2016).
- Suprynowicz, F. A., et al. Conditionally reprogrammed cells represent a stem-like state of adult epithelial cells. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (49), 20035-20040 (2012).
- Awatade, N. T., et al. Significant functional differences in differentiated Conditionally Reprogrammed (CRC)- and Feeder-free Dual SMAD inhibited-expanded human nasal epithelial cells. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (2), 364-371 (2021).
- Veit, G., et al. Allosteric folding correction of F508del and rare CFTR mutants by elexacaftor-tezacaftor-ivacaftor (Trikafta) combination. JCI Insight. 5 (18), 139983 (2020).
- Dale, T. P., Borg D’anastasi, E., Haris, M., Forsyth, N. R. Rock Inhibitor Y-27632 enables feeder-free, unlimited expansion of Sus scrofa domesticus swine airway stem cells to facilitate respiratory research. Stem Cells International. 2019, 1-15 (2019).
- Laselva, O., et al. Rescue of multiple class II CFTR mutations by elexacaftor+tezacaftor+ivacaftor mediated in part by the dual activities of elexacaftor as both corrector and potentiator. The European Respiratory Journal. 57 (6), 2002774 (2021).
- Li, X., Krawetz, R., Liu, S., Meng, G., Rancourt, D. E. ROCK inhibitor improves survival of cryopreserved serum/feeder-free single human embryonic stem cells. Human Reproduction. 24 (3), 580-589 (2008).
- Neuberger, T., Burton, B., Clark, H., Van Goor, F. Use of primary cultures of human bronchial epithelial cells isolated from cystic fibrosis patients for the pre-clinical testing of CFTR modulators. Methods in Molecular Biology. 741, 39-54 (2011).
- Laselva, O., et al. Emerging pre-clinical modulators developed for F508del-CFTR have the potential to be effective for ORKAMBI resistant processing mutants. Journal of Cystic Fibrosis. 20 (1), 106-119 (2021).
