In vivo Imágenes de tejidos biológicos con fluorescencia combinada de dos fotones y microscopía de dispersión Raman estimulada
Summary
La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) permite obtener imágenes sin etiquetas de biomoléculas en función de su vibración intrínseca de enlaces químicos específicos. En este protocolo, se describe la configuración instrumental de un SRS integrado y un microscopio de fluorescencia de dos fotones para visualizar las estructuras celulares en la médula espinal de ratones vivos.
Abstract
La microscopía de dispersión Raman estimulada (SRS) permite obtener imágenes sin etiquetas de los tejidos biológicos en su microambiente natural basado en la vibración molecular intrínseca, proporcionando así una herramienta perfecta para el estudio in vivo de los procesos biológicos a resolución subcelular. Al integrar imágenes de fluorescencia excitada de dos fotones (TPEF) en el microscopio SRS, las imágenes in vivo de doble modal de los tejidos pueden adquirir información bioquímica y biofísica crítica desde múltiples perspectivas, lo que ayuda a comprender los procesos dinámicos involucrados en el metabolismo celular, la respuesta inmune y la remodelación de tejidos, etc. En este protocolo de video, se introduce la configuración de un sistema de microscopio TPEF-SRS, así como el método de imágenes in vivo de la médula espinal animal. La médula espinal, como parte del sistema nervioso central, juega un papel crítico en la comunicación entre el cerebro y el sistema nervioso periférico. La vaina de mielina, abundante en fosfolípidos, rodea y aísla el axón para permitir la conducción saltatoria de los potenciales de acción. Las imágenes in vivo de las vainas de mielina en la médula espinal son importantes para estudiar la progresión de las enfermedades neurodegenerativas y la lesión de la médula espinal. El protocolo también describe la preparación animal y los métodos de imagen TPEF-SRS in vivo para adquirir imágenes biológicas de alta resolución.
Introduction
La microscopía Raman1,2 está emergiendo como un poderoso método libre de etiquetas para obtener imágenes de tejidos biológicos basado en las frecuencias características de varios enlaces químicos en biomoléculas. Debido a su capacidad de imagen no invasiva y bien adaptativa, la microscopía Raman se ha utilizado ampliamente para obtener imágenes de componentes enriquecidos con lípidos en tejidos biológicos como la vaina de mielina3,4,5, los adipocitos6,7 y las gotas lipídicas8,9,10 . La señal de dispersión Raman estimulada (SRS) adquirida como ganancia Raman estimulada (SRG) o pérdida Raman estimulada (SRL) no tiene fondo, mostrando un parecido espectral perfecto con la dispersión Raman espontánea11,12. Además, SRL y SRG dependen linealmente de la concentración de analitos, lo que permite el análisis cuantitativo de los componentes bioquímicos9,11,13. La microscopía de fluorescencia excitada de dos fotones (TPEF) se ha utilizado ampliamente para imágenes biológicas in vivo debido a su capacidad de seccionamiento óptico inherente, profundidad de penetración profunda y baja fototoxicidad14,15,16. Sin embargo, el rendimiento de las imágenes TPEF depende de las características de las etiquetas fluorescentes, y el número de colores resolubles es limitado debido a los espectros de fluorescencia de banda ancha8,17,18,19. Las imágenes SRS sin etiqueta y las imágenes TPEF basadas en fluorescencia son dos modalidades de imágenes complementarias, y su combinación puede proporcionar abundante información biofísica y bioquímica de los tejidos. Estas dos modalidades de imagen se basan en los procesos ópticos no lineales (NLO), lo que permite una integración simple en un sistema de microscopio. La combinación de las imágenes SRS y TPEF, las llamadas imágenes de doble modal, permite la obtención de imágenes de alta dimensión y el perfil de células y tejidos, lo que facilita una comprensión integral de los sistemas biológicos complejos. Específicamente, la microscopía SRS de picosegundos (ps) puede lograr imágenes de enlace químico con alta resolución espectral en comparación con la técnica SRS de femtosegundo (fs)11, lo que permite diferenciar múltiples componentes bioquímicos en el tejido biológico, especialmente en la región de huellas dactilares abarrotada20,21. Además, en comparación con otro sistema de microscopio NLO de doble modal de uso común con integración de microscopio de dispersión anti-Stokes coherente (CARS), SRS muestra un rendimiento superior al CARS en términos de interpretación espectral y de imagen, así como sensibilidad de detección11. El microscopio SRS-TPEF se ha utilizado como una poderosa herramienta para estudiar diversos sistemas biológicos, como Caenorhabditis elegans9,22, Xenopus laevis tadpole brain5, cerebro de ratón23,24, médula espinal25,26, nervio periférico27, tejido adiposo7, etc.
La médula espinal junto con el cerebro constituye el sistema nervioso central (SNC). La visualización de las actividades celulares en el SNC in vivo en condiciones fisiológicas y patológicas es fundamental para comprender los mecanismos de los trastornos del SNC28,29,30 y para desarrollar las terapias correspondientes31,32,33. La vaina de mielina, que envuelve y aísla los axones para la conducción potencial de acción a alta velocidad, desempeña un papel importante en el desarrollo del SNC. La desmielinización se considera un sello distintivo en los trastornos de la sustancia blanca, como la esclerosis múltiple34. Además, después de una lesión medular35, los restos de mielina pueden modular la activación de los macrófagos, contribuyendo a la inflamación crónica y a la lesión secundaria36. Por lo tanto, las imágenes in vivo de la vaina de mielina junto con las neuronas y las células gliales en modelos de ratones vivos son de gran ayuda para comprender los procesos dinámicos en los trastornos del SNC.
En este protocolo, se describen los procedimientos fundamentales de configuración de un microscopio TPEF-SRS construido en casa y se introducen los métodos de imagen in vivo de doble modal para la médula espinal de ratón.
Protocol
Representative Results
Discussion
En este protocolo, se describe en detalle la configuración básica del microscopio TPEF-SRS. Para las imágenes SRS, la bomba y los haces stokes se superponen temporal y espacialmente dentro del OPO. Sin embargo, esta superposición puede interrumpirse después de pasar a través del sistema de microscopio. Por lo tanto, la optimización espacial y temporal de la colocalización de la bomba y los haces de Stokes es necesaria y crítica para lograr una imagen SRS óptima. El retardo temporal entre la bomba y el haz de S…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este trabajo fue apoyado por el Consejo de Becas de Investigación de Hong Kong a través de subvenciones 16103215, 16148816, 16102518, 16102920, T13-607/12R, T13-706/11-1, T13-605/18W, C6002-17GF, C6001-19E, N_HKUST603/19, la Comisión de Innovación y Tecnología (ITCPD/17-9), el Esquema de Área de Excelencia del Comité de Becas Universitarias (AoE/M-604/16, AOE/M-09/12) y la Universidad de Ciencia y Tecnología de Hong Kong (HKUST) a través de la subvención RPC10EG33.
Materials
| #2 Forceps | Dumont | 11223-20 | For laminectomy |
| 10X objective | Nikon | CFI Plan Apo Lambda 10X | |
| 25X objective | Olympus | XLPLN25XSVMP2 | |
| Burn cream | Betadine | ||
| Camera | Sony | α6300 | |
| Current amplifier | Stanford research | SR570 | |
| Current photomultiplier modules | Hamamatsu | H11461-01 | |
| D2 665 nm long-pass dichroic mirror | Semrock | FF665-Di02-25×36 | For directing epi-fluorescence signal to the detection module |
| D3 700 nm short-pass dichroic mirror | Edmund | 69-206 | For separating SRS from TPEF detection path |
| Depilating cream | Veet | ||
| FS1 975 nm short-pass filter | Edmund | 86-108 | For blocking stokes beam |
| FS1 Bandpass filter | Semrock | FF01-850/310 | For blocking stokes beam |
| Fs2 Bandpass filter | Semrock | FF01-525/50 | For selecting YFP signal |
| Fs2 Shortpass filter | Semrock | FF01-715/SP-25 | For blocking fs excitation laser beam |
| Half-wave plate | Thorlabs | SAHWP05M-1700 | |
| High-speed photodetector | MenloSystems | FPD 310-F | For checking Stokes beam modulation |
| Iodine | Betadine | ||
| IR Scope | FJW | FIND-R-SCOPE Infrared Viewer 2X Kit Model 84499C2X | |
| Iris | Thorlabs | CPA1 | |
| L1 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
| L10 | Thorlabs | LA4052-A | |
| L2 | Thorlabs | LA1422-B | |
| L3 | Thorlabs | AC254-050-B | |
| L4 | Thorlabs | AC254-060-B-ML | |
| L7 | f=100 mm, AB coating | ||
| L8 | Thorlabs | LA4874-A | |
| L9 | Thorlabs | AC254-035-B-ML | |
| Lock-in amplifier | APE | ||
| Mirror | Thorlabs | PF10-03-P01 | |
| Motorized flipper | Thorlabs | MFF101/M | |
| multifunctional acquisition card | National Instrument | PCIe-6363 | |
| Oscilloscope | Tektronix | TDS2012C | |
| Photodiode | APE | For detecting SRS signal | |
| Picosecond laser source | APE | picoEmerald | |
| Polarizing beam splitter | Thorlabs | CCM1-PBS252/M | |
| Power meter | Newport | 843-R | |
| Saline | Braun | ||
| Scan lens L5 | Thorlabs | SL50-CLS2 | |
| Scanning mirror | Cambridge Technology | 6215H | |
| Silicone gel | World Precision Inc. | KWIK-SIL | |
| Ti:sapphire fs laser | Coherent | Chameleon Ultra II | |
| Tube lens L6 | Thorlabs | TTL200-S8 |
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