Summary
Her præsenterer vi en ligetil protokol for ikke-invasiv genetisk prøveudtagning af sommerfuglepopulationer baseret på feltindsamling af resterende ægrestaffald. Det kan bruges til at bekræfte artsidentitet og kvantificere genetisk variation. Denne protokol kan let tilpasses bredere grupper til samfundsvidenskabelig involvering.
Abstract
Den globale nedgang i antallet af insekter fortsætter med at accelerere. Effektiv genetisk prøveudtagning er kritisk nødvendig for at fremme forståelsen af mange taxa og løse eksisterende videnshuller. Denne protokol repræsenterer en demonstreret metode til ikke-destruktiv prøveudtagning af sjældne sommerfugle til populationsgenetisk struktur eller DNA-stregkodningsanalyser. Det bruger chorion af udklækket sommerfugl ovae til at give tilstrækkelig høj mængde og kvalitet DNA til vellykket gensekventering for at bekræfte artsidentitet og kvantificere genetisk variation. Det kan især være nyttigt, når andre vævsprøvetagningsteknikker er upraktiske eller utilgængelige. Selvom den er udviklet til en lepidopteran, kan den ikke desto mindre let tilpasses til brug med andre insektarter. Det blev specielt designet med brugervenlighed som et mål for at hjælpe med at maksimere bred implementering af enkeltpersoner med varierende erfaring og færdighedsniveauer, såsom samfundsforskere, bevaringsudøvere og studerende, og til brug over store geografiske områder for at lette bred befolkningsprøveudtagning. De genererede data kan hjælpe med at informere taksonomiske og noteringsbeslutninger, bevarings- og forvaltningsforanstaltninger og forbedre grundlæggende økologisk forskning.
Introduction
Effektiv populationsgenetisk prøveudtagning af sjældne, faldende og/eller listeopførte insekttaxa er ofte afgørende for at hjælpe med at informere bevarings- og forvaltningsforanstaltninger. Dødelige eller skadelige vævsprøvetagningsmetoder anvendes rutinemæssigt til mange genetiske analyser. Disse metoder er imidlertid uønskede eller ikke tilladt, fordi de kan forårsage skade på sårbare eksisterende befolkninger eller påvirke adfærd og fitness negativt. Forskellige ikke-dødelige eller ikke-invasive prøveudtagningsteknikker, der involverer væv såsom hele ben, antenne- eller vingeklip, larveeksuviae eller hæmolymfe fra defensive sekreter og andre produkter, såsom frass, har været egnede til insektgenetisk forskning 1,2,3,4,5,6,7,8,9 . Den samlede gennemførlighed og anvendelighed af disse forskellige vævsprøvetagningsteknikker varierer betydeligt baseret på biologi, økologi, adfærd, størrelse og sjældenhed af fokusorganismen, situationen og individer, der indsamler materialet. For eksempel kræver hele ben eller vedhængsklip midlertidig fangst og omhyggelig håndtering af flere personer i et passende livsstadium, typisk af erfarent personale. På samme måde vil vævskilder, såsom larveeksuviae eller frass, sandsynligvis kun være praktiske, hvis organismerne er i fangenskab eller midlertidigt holdes i en passende periode.
For forskningsspørgsmål, der stilles på befolkningsniveau, såsom dem, der vedrører potentiel taksonomisk differentiering eller genetisk struktur, er prøveudtagning i en bredere tidsmæssig eller geografisk skala (dvs. regional eller kontinental) ofte påkrævet. Som følge heraf kan visse ikke-invasive vævskilder være fuldstændig upraktiske eller i det mindste ineffektive at indsamle i mængde. Prøveindsamling i sådanne skalaer kan desuden være logistisk eller økonomisk upraktisk eller uoverkommelig for individuelle forskere eller endnu mindre felthold at foretage. Mens det direkte engagement fra samfundsforskere i stigende grad er blevet vedtaget af forskersamfundet for at hjælpe med at løse mange af disse udfordringer og fremskynde big data-drevet indsamling, har vedtagelsen været begrænset til undersøgelser, der involverer ikke-destruktiv, ikke-invasiv eller eDNA-prøveudtagning10,11,12.
For at hjælpe med at overvinde nogle af disse potentielle begrænsninger demonstrerede vi, at chorionen fra klækkede sommerfuglovae kunne give tilstrækkelig høj mængde og kvalitets-DNA til vellykket gensekventering for at bekræfte artsidentitet og kvantificere genetisk variation. Vi testede efterfølgende forskellige indsamlingsprotokoller ved hjælp af denne teknik13. Dette pilotarbejde tjente som grundlag for yderligere metodologisk forfining. Dette papir beskriver detaljeret den resulterende enkle, men omfattende reviderede feltindsamlingsprotokol, der blev rullet ud for samfundsforskere og andet ikke-ekspertpersonale. Denne protokol er en del af en omfattende populationsstrukturanalyse af den frostede elversommerfugl (Callophrys irus) for at hjælpe med at informere fremtidige bevaringsforanstaltninger og en føderal bestemmelse af muligvis notering i henhold til den amerikanske lov om truede arter. Selvom det potentielt er mere arbejdskrævende end nogle ikke-invasive metoder, gør manglen på nødvendig organismekontakt og brugervenlighed det til en potentielt levedygtig model, der kan anvendes på andre populationsgenetiske forskningsprogrammer rettet mod et udvalg af både almindelige insekter og dem af bevaringsbekymring, som efterlader resterende ægrester fra nyligt udklækkede nymfer eller larver. Protokolsproget, der præsenteres her, blev specielt udviklet til sommerfugle i familien Lycaenidae og til brug for ikke-eksperter, der her er defineret som samfundsforskere eller andre individer (f.eks. Agenturbiologer, praktikanter) med begrænset entomologisk erfaring.
Protocol
1. Formidling af forsyninger til samfundsforskere
- Gennemgå og saml omhyggeligt den fulde liste over indsamlingsrelaterede forsyninger, der er nødvendige, ved at konsultere den komplette materialefortegnelse.
- Hvis prøveindsamlingen finder sted flere steder og/eller af flere personer/teams, skal du samle og organisere alle nødvendige forsyninger i separate enheder, der kan implementeres (figur 1 og figur 2).
- Transportforsyninger (deployerbare enheder) til samfundsforskere eller andet personale, der er ansvarligt for feltindsamling.
- Hvis personalet ikke er lokalt, skal du omhyggeligt pakke forsyninger (hver deployerbar enhed) i en separat papforsendelseskasse med en komplet forsendelsesetiket og sende.
BEMÆRK: Hurtig forsendelse er ikke påkrævet på nuværende tidspunkt.
2. Forberedelse af Fællesskabets samling af videnskabsfolk
- Efter modtagelse af indsamlingsartikler, herunder indsamlingsautomaten, skal du omhyggeligt gennemgå den laminerede forsyningsliste og foretage en fuldstændig opgørelse. Giv projektlederen besked, hvis der mangler forsyninger.
- Forfyld 1,5 ml mikrocentrifugerør med 180 μL lysisbuffer, påfør etiketter med en fortrykt unik ID-etiket på hvert mikrocentrifugerør, og anbring alle rør i opbevaringsboksen med 64 mikrocentrifugerør. Fastgør låget ordentligt efter ilægning.
BEMÆRK: Hvis etiketprintere ikke er tilgængelige, skal du anvende unikke ID-numre på siden og låget på hvert hætteglas ved hjælp af en ethanolsikker markør. - Sørg for, at alt digitalt udstyr (f.eks. smartphone eller kamera) er fuldt opladet, og at eventuelle ekstra batterier er pakket.
- Fyld delvist en lille køler med is til feltopbevaring og lokal transport af de indsamlede prøver.
- Pak alle indsamlingsartikler i indsamlingsboksen eller lignende robust, vejrbestandig beholder for sikker transport og konsolideret opbevaring.
- Gennemgå den ikke-destruktive genetiske prøveindsamlingsprotokol i detaljer, inden du går ind i marken.
BEMÆRK: Brug den laminerede og kondenserede, illustrerede protokol til yderligere vejledning på området (supplerende figur S1 og supplerende figur S2).
3. Prøveindsamling i marken
- Når du ankommer til feltstedet, skal du bruge en blyant eller pen til al slags vejr til at registrere tidspunktet på dagen, datoen, det samlede ejendomsnavn (f.eks. Apalachicola National Forest), navnet på det specifikke feltsteds placering eller beskrivelse og GPS-læsning, hvis det er tilgængeligt, og det fulde navn og roller for alle tilstedeværende personer.
- Find et passende levested med tilstedeværelsen af larveværtsplantearter, der er specifikke for målsommerfuglen.
BEMÆRK: Vær forsigtig med at undgå eller minimere indvirkningen på følsomme levesteder, plantepopulationer og dyreliv. Derudover skal du sørge for at sikre alle relevante grundejertilladelser og / eller tilladelser, inden du får adgang til et websted og prøveindsamlingshændelser. - Brug en smartphone eller et kamera til at tage detaljerede fotografier af alle feltsteder, prøveindsamlingssteder, værtsplanter og andre oplysninger, der kan være relevante for projektet. Brug smartphones eller andre kameraer, der optager GPS-koordinater.
BEMÆRK: Foto Geotagging skal aktiveres på alle smartphones. - Søg grundigt i alle larveværtsplantedele, såsom blade, blomsterknopper, blomster eller udviklende frugt, der vides at blive udvalgt ved ovipositing (æglægning) voksne kvindelige sommerfugle til rugeæg. For de fleste Lycaenidae skal du kigge efter hvide, klækkede æg med et tydeligt hul i midten, der ligner en donut, hvorfra den nyfødte larve opstod (figur 3). Kig efter unhatched æg, der er noget mørkere i farve, ofte grøn eller blålig, og vil være helt intakt uden et hul i midten (figur 4). Brug en håndlinse eller anden forstørrelsesanordning til at inspicere hvert æg nøje.
- Når et klækket æg er fundet, skal du lægge nitrilhandsker på begge hænder.
- Brug ren, steril, spids tang til at gribe og forsigtigt trække det klækkede æg af værtsplanten og læg det direkte i et mærket mikrocentrifugerør, der er fyldt med lysisbuffer taget fra opbevaringsboksen med 64 brønde.
BEMÆRK: Noget værtsplanteoverførselsmateriale (mindre end 15 mm i diameter) er acceptabelt og normalt under indsamling. - Der indsamles mindst 5 prøver pr. værtsplanteplaster/-sted (hver indeholdende 1-20 rugeæg) med henblik på >50 æg i alt på et sted, hvis det er tilgængeligt.
BEMÆRK: Dette vil hjælpe med at sikre, at der i det mindste indsamles noget væv ved hver prøveplante / plaster og øger chancerne for at opdage DNA (personlig observation). - Efter hver ægopsamling skal du omhyggeligt rengøre tangspidserne ved at dyppe dem i et hætteglas med 95% ethanol eller ved at overhælde med 95% ethanol fra en klemmeflaske eller ved at bruge spritservietter.
BEMÆRK: Dette vil hjælpe med at minimere vævsoverførsel mellem prøveudtagningshændelser. - Hvis det er muligt, skal du samle flere rugeæg (1-20 æg) fra flere planter i samme værtsplaster i et enkelt mikrocentrifugerør og lukke låget fast. For sommerfuglearter, der bruger større urteagtige eller træagtige værtsarter, skal du samle flere æg fra forskellige steder på samme plante, hvis værtspletter er begrænsede.
BEMÆRK: Planter er i samme værtsplaster, hvis deres blade rører hinanden. Hvis der er en mærkbar fysisk adskillelse mellem planter eller pletter, bør dette betragtes som en anden prøve. Hvis der opsamles en anden vævstype, såsom larveeksuviae eller et enkelt ben, skal du kun placere et enkelt ben, benfragment eller larveeksuvia i et mikrocentrifugerør (en prøve pr. Individ). - Sørg for, at alt indsamlet materiale er helt nedsænket i lysisbufferen i hvert 1,5 ml mikrocentrifugerør. Tryk på bunden af det pågældende rør på en hård overflade for at gendykke eventuelle prøver, hvis det er nødvendigt.
- Tør tangen af til tørre med en ren engangsserviet.
BEMÆRK: Omhyggelig tangrensning er afgørende for at undgå krydskontaminering mellem prøver. - Ved indsamling af en ny prøve kasseres brugte nitrilhandsker og erstattes med et rent par.
- I en vejrbestandig feltnotesbog skal du bruge en blyant eller kuglepen til al slags vejr til at registrere den unikke ID-etiket, der er tildelt fra mikrocentrifugerøret, sammen med prøvetypen (f.eks. æg, larveexuviae eller ben), det omtrentlige antal rugeæg og indsamlingsoplysninger såsom samlernavn(e), dato, placering, værtsplantearter og eventuelle yderligere noter (figur 2).
- Anbring det lukkede mikrocentrifugerør med ægaffaldsprøve tilbage i opbevaringsboksen med 64 brønde.
- Vedligehold opbevaringsboksen med 64 brønde i en køler med is, mens du er i marken.
- Vedligehold alle andre indsamlingsforsyninger i indsamlingsboksen, mens du er i marken for sikker og konsolideret opbevaring og transport mellem steder.
4. Når feltsamlingen er fuldført
- Sørg for, at alle mikrocentrifugerør, der indeholder prøver, er i opbevaringsboksen med 64 brønde i en køler med is til transport.
- Læg alle feltindsamlingsforsyninger tilbage i indsamlingsboksen.
- Transporter alle prøver tilbage til kontoret eller laboratoriet, og dobbelttjek omhyggeligt hvert mikrocentrifugerør for at sikre, at alt prøvemateriale er helt nedsænket i lysisbuffer.
- Anbring 64-brønds mikrocentrifuge opbevaringsboks med prøver i en fryser indtil forsendelse eller forarbejdning.
BEMÆRK: En gennemsnitlig kommerciel fryser på -18 °C er acceptabel til kortvarig opbevaring. - Vurder omhyggeligt alle forsyninger i indsamlingsværktøjskassen, og udskift dem efter behov.
BEMÆRK: Dette er især vigtigt, hvis der er planlagt flere feltindsamlingshændelser. - Opbevar indsamlingsboksen på et sikkert sted indtil næste feltindsamlingshændelse.
- Download alle digitale billeder, og sørg for, at alle sikkerhedskopieres sikkert på en server eller et skybaseret lagersystem.
- Scan eller fotografer de originale vejrbestandige sider i feltnotesbøger eller feltdatablade, der indeholder indsamlingsdata, indtil alle oplysninger kan indtastes i et projektregneark eller en database.
5. Indsendelse af prøver og data
- Fjern alle 64-brønds mikrocentrifuge opbevaringsbokse med prøver fra fryseren.
- Pak omhyggeligt opbevaringsbokse med 64 brønde med prøver og feltnotesbogen eller feltdatabladene i en standardforsendelsesboks, vedhæft den medfølgende forsendelsesetiket med den originale afsenders kontonummer, og send via eksprestransportørgaranteret levering natten over næste dag til projektdirektøren.
- Send pakkesporingsnummeret og en kopi af de scannede notesbogsider eller feltdatablade til projektdirektøren.
6. DNA-ekstraktion
- Når opbevaringskasserne med 64 brønde med mikrocentrifuge er modtaget, opbevares de ved -20 °C til konservering af DNA i prøver, indtil de er klar til DNA-ekstraktion.
- I laboratoriet ekstraheres DNA ved at male insektvæv, der er opbevaret i lysisbuffer efter optøning fra -20 °C. Der tilsættes 20 μL proteinase K, og prøven lægges i blød natten over ved 56 °C i en opvarmet inkubator i højst 24 timer.
- Tilføj de relevante rengørings- og vaskebuffere i henhold til den specifikke producents anbefaling13.
- Prøven ophængt i bufferen overføres til en centrifugeringskolonne, der er fastgjort til et 2 ml opsamlingshætteglas.
- Drej ned ved 6.021 × g i 60 s ved hjælp af en centrifuge. Tilsæt de passende vaskebuffere, og drej korrekt ned.
- Frigør bundet DNA ved hjælp af undvigelsesbuffer (30 μL), og centrifugering ned i et frisk 1,5 ml mikrocentrifugerør. Opbevares ved -20 °C.
BEMÆRK: Fortsæt med sekventering, hvis DNA-koncentrationen overstiger 0,010 ng / ml. Se figur 5 for DNA-koncentration efter vævstype.
7. Dataanalyse af DNA-sekvenser
- Trim eller rediger basisopkald af lav kvalitet i resulterende sekvenser.
- Forespørgselssekvenser mod offentlige databaser til bekræftelse af artsidentifikation.
- Juster sekvenser til hinanden for sammenligning af forskelle mellem individer.
Representative Results
Materialer til indsamling af op til 563 prøver blev sendt til otte bevarings- og samfundsforskere fra ni stater på tværs af artsområdet i det østlige Nordamerika. Materialer blev sendt ud over tre måneder i løbet af 2021 forud for lokale spidsbelastningstider. Til dato har vi modtaget i alt 160 C. irus vævsprøver, der er indsamlet (tabel 1). Genomisk DNA blev ekstraheret efter en protokol for denne prøvetype beskrevet af Storer et al.14. Ud af disse 160 prøver blev DNA med succes ekstraheret fra 88 med en gennemsnitlig koncentration på 1,67 ng / μL (SE ± 2,98), og det højeste DNA-udbytte var 26,8 ng / μL. Koncentrationerne blev kvantificeret ved hjælp af et højfølsomt analysesæt i henhold til producentens anvisninger med 2 μL ekstrakt.
Mens det samlede antal modtagne prøver er væsentligt lavere end det samlede samlede antal materialer, der anvendes til indsamling, er dette overvejende en artefakt af at give en overflod af indsamlingsmaterialer til den primære samler eller teamleder for at sætte dem i stand til at have den maksimale fleksibilitet til at inkludere flere indsamlingssteder og / eller samfundsforskere involveret, hvis det ønskes. Desuden er C. iris en sjælden og faldende taxon repræsenteret af begrænsede og ofte relativt små populationer i hele sit eksisterende sortiment. På trods af denne begrænsning er det samlede antal modtagne vævsprøver betydeligt, især sammenlignet med hvad der kunne forventes med en mere traditionel prøveudtagning af individuelle voksne sommerfugle.
Figur 1: Individuelle deployerbare enheder af alle nødvendige forsyninger, der afventer forsendelse til samfundsforskere eller andet personale, der er ansvarligt for feltindsamling. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 2: Individuel deployerbar enhed inklusive alle forsyninger, klar plastindsamlingskasse og udfyldt ekspresbærermærke, der afventer forsendelse til samfundsforskere eller andet personale, der er ansvarligt for feltindsamling. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 3: Foto af udklækket frostet elversommerfugl (Callophrys irus) æg på vild lupin (Lupinus perennis), der viser et tydeligt hul i midten, hvorfra den nyfødte larve opstod. Bemærk, at den overordnede farve på det klækkede æg er hvidt. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 4: Foto af uudklækkede udklækkede frostede elversommerfugl (Callophrys irus) æg på vild lupin (Lupinus perennis). Bemærk, at uafsluttede æg mangler et mærkbart centralt hul, og at deres overordnede farve er blågrøn. Klik her for at se en større version af denne figur.
Figur 5: DNA-koncentration efter vævstype. Boksens midterlinjer repræsenterer medianen, hver boks udvider IQR, og boksknurhårene er 1,5 × IQR, hvor eventuelle punkter udenfor er outliers. Prøver, der indeholdt en enkelt ægkasse, havde kun et ægtilfælde, og prøver indeholdende flere ægkasser havde mindst to tilfælde, hvor antallet af tilfælde varierede fra 2 til 20 (gennemsnit = 5,3) pr. prøve. Forkortelse: IQR = interkvartilområde. Klik her for at se en større version af denne figur.
| Stat | Æg sag | Æg sager | Frass | Ben | Molt | Beløb i alt |
| Arkansas | 2 | 2 | ||||
| Florida | 3 | 10 | 7 | 22 | 42 | |
| Michigan | ||||||
| København. | 24 | 6 | 15 | 45 | ||
| New York | 30 | 30 | ||||
| Ohio | ||||||
| Wisconsin | 9 | 5 | 5 | 19 | ||
| Oklahoma | 16 | 6 | 22 | |||
| Beløb i alt | 36 | 21 | 16 | 65 | 22 | 160 |
Tabel 1: Antal og type vævsmateriale indsamlet efter tilstand.
Supplerende figur S1: Forside af tosidet, lamineret, kondenseret og illustreret protokol til brug i marken. Klik her for at downloade denne fil.
Supplerende figur S2. Bagside af tosidet, lamineret, kondenseret, illustreret protokol til brug i marken. Klik her for at downloade denne fil.
Discussion
Denne protokol beskriver en feltmetode til ikke-destruktiv prøveudtagning af sjældne sommerfugle til populationsgenetisk struktur eller DNA-stregkodningsanalyser. De overordnede fordele ved denne protokol er specielt designet til at hjælpe med at maksimere bred implementering af enkeltpersoner med varierende erfaring og færdighedsniveauer såsom samfundsforskere, bevaringsudøvere og studerende. Disse omfatter relativt lave samlede omkostninger, let at erhverve forsyninger og udstyr, en ligetil og tilgængelig metode uden mange alt for komplekse trin og nem implementering over et bredt geografisk område. Det er desuden rettet mod resterende organisk materiale, der eliminerer behovet for midlertidigt at fange eller manipulere og i processen potentielt skade levende organismer for at erhverve genetiske prøver. Desuden forlænger det den potentielle periode, der er tilgængelig for prøveindsamling ud over den traditionelle fænologi eller levetid for et bestemt livsstadium, hvilket øger fleksibiliteten og den samlede indsamlingsmulighed for at hjælpe med at maksimere antallet af prøver.
Mens den centrale taxon for denne indsats var den frostede elfinsommerfugl, en udbredt, men faldende habitatspecialist, kan denne protokol anvendes mere bredt på mange andre insekter, herunder dem, der er af bevaringsmæssig bekymring. På samme måde kan protokollen, selv om den er rettet mod indsamling af rugeæg som kilde til genetisk materiale, let tilpasses andre, potentielt mere traditionelle prøver (f.eks. ben, vingefragmenter, antenneklip) eller endda hele organismer. Dette aspekt er imidlertid også en potentiel begrænsning af protokollen. Selvom langt de fleste trin er designet til at være relativt enkle og hurtige at udføre, er omfattende søgning af pletter af larveværtsplanter efter rugeæg, som individuelt typisk er <1,0 mm i diameter, tids- og arbejdskrævende. Ikke desto mindre er en sådan omfattende prøveudtagningsaktivitet særlig ideel til et større netværk af deltagere såsom samfundsforskere.
Som med andre feltbaserede projekter er omhyggelig forberedelse afgørende. Dette inkluderer at foretage en komplet oversigt over de forsyninger, der er nødvendige for at sikre, at der ikke mangler varer, at alt nødvendigt forberedelsesarbejde er afsluttet, og de er velorganiserede, sikkert pakket og klar til implementering i marken. Derudover bør alt personale i marken, især dem, der foretager vævsindsamlingen, gennemgå indsamlingsprotokollen i detaljer forud for enhver indsamlingsbegivenhed og rette eventuelle spørgsmål til personer, der fører tilsyn med projektet. En gang i marken kræver prøveindsamlingsdelen af protokollen omhyggelig opmærksomhed på detaljer. Dette omfatter lokalisering og omhyggelig inspektion af eventuelle æg for at sikre, at de er udklækket og dermed egnede til indsamling, grundig rengøring af tang, udskiftning af handsker for at reducere vævsoverførsel mellem prøveudtagningshændelser og sikring af, at vævsprøver er helt nedsænket i lysisbuffer inden for hvert 1,5 ml mikrocentrifugerør. Endelig er det vigtigt at registrere nøjagtige og detaljerede data, hvilket omfatter sammenkædning af den unikke ID-etiket, der er tildelt fra mikrocentrifugerøret, med den specifikke prøve, der er taget, og alle andre relevante indsamlingsoplysninger. Selvom dette trin er rutine inden for videnskabelig forskning, skal det ofte afklares grundigt og styrkes for et samfundsvidenskabeligt publikum.
Her demonstrerer vi den potentielle udnyttelse af samfundsforskere til ikke-dødelig prøveindsamling fra små, sjældne og truede arter. Der er dog nogle potentielle begrænsninger at huske på, når man analyserer eventuelle resulterende genetiske data. For eksempel, mens pooling af prøver fra et enkelt plaster øger chancerne for at genvinde nok DNA til påvisning, introducerer det også potentielt heterozygositet. Derudover, da protokollen involverer indsamling af chorion fra udklækkede æg, kan kun kvindelige sommerfugle, der repræsenterer forældrenes DNA, udtages inden for en befolkning. Ikke desto mindre, da der ikke var nogen tidligere genetiske data på populationsniveau til rådighed for C. irus, kan den opnåede indsigt kun gavne bevarelse og forvaltning af arter. Selv om det f.eks. ville være nødvendigt med et grundigt, detaljeret undersøgelsesdesign og omhyggelig markeringsudvælgelse for at kunne vurdere populationsstrukturen tilstrækkeligt, kunne den prøveudtagningsprotokol, der er skitseret her, og anvendelsen af cytokrom c oxidase subunit 1 (CO1) DNA-stregkodning anvendes til at detektere forekomsten af sjældne eller truede taxa. Yderligere diskussion af nytten og anvendelsen af DNA-sekventering fra ikke-dødelig prøveudtagning beskrevet her er detaljeret af Storer et. al.14.
Ud over det primære mål om at indsamle prøver til genetisk analyse understreger protokollen også, at deltagerne tager detaljerede digitale fotografier af alle feltsteder, indsamlingssteder, larveværtsplanter, der er til stede, og andre elementer i det omgivende habitat, der kan være relevante. En sådan dokumentation hjælper med at give en generel habitatvurdering, der er nyttig til at illustrere eksisterende lokalitetsforhold såsom plantefænologi, værtsressourcetæthed og forvaltningshistorie (f.eks. nylig foreskrevet brand). Sådanne oplysninger er især nyttige i forbindelse med projekter, hvor der udtages stikprøver over en længere tidsmæssig periode for at muliggøre mere detaljerede miljøsammenligninger.
Endelig, da den globale insektnedgang fortsætter med at accelerere, er der kritisk behov for en udvidet artsvurderings- og overvågningsindsats15,16. Brugen af mere udbredt deltagende engagement fra samfundsforskere, studerende (f.eks. U.S. Fish and Wildlife Service praktikanter og stipendiater) og bevaringsudøvere giver stadig mere levedygtige muligheder for omfattende dataindsamling af mange typer, herunder DNA-prøver. Derfor har de data, der genereres fra denne protokol, mange mulige anvendelser. Disse omfatter hjælp til at informere bevaringsforanstaltninger (f.eks. Planlægning, genopretning og forvaltning), listebeslutninger eller vurderinger af artsstatus og økologisk, befolkningsmæssig og taksonomisk forskning.
Disclosures
Forfatterne har ingen interessekonflikter at oplyse.
Acknowledgments
Forfatterne ønsker at takke David Cuthrell, Amanda Dillon, Steve Fuller, Neil Gifford, Heidi Holman, Dean Jue, Sally Jue, Daniel Kennedy, Genevieve Kozak, Rebecca Longenecker, Maureen McClung, Matt Moran, Robin Niver, Brenda Smith, Hunter Trowbridge og Jessup Weichelt for hjælp med forskellige aspekter af projektet, herunder logistik, koordinering, tilladelse og / eller prøveindsamling. Denne forskning blev finansieret gennem et tilskud fra US Fish and Wildlife Service (Federal Award Identification Number F20AC00356) administreret af Wildlife Management Institute (tilskud SA 2021-01).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 14 quart Igloo Playmate Cooler | Amazon | NA | portable cooler Amount per deployable unit: 1 cooler |
| 250 DNeasy Mini Spin Columns, Proteinase K, Buffers, Collection Tubes (2 mL) | Qiagen | 69506 | Qiagen DNeasy Blood & Tissue Kit Amount per deployable unit: NA |
| Andwin Scientific Supplier Diversity Partner LAB MARKERS BLACK | FisherSci | NC9280166 | ethanol proof lab marker Amount per deployable unit: 2 markers |
| Cardboard shipping box | shipping box Amount per deployable unit: as needed |
||
| Eisco Polyethylene Wash Bottles, LDPE | FisherSci | S14091 | lab grade spray or squirt bottle (for ethanol or alcohol) Amount per deployable unit: 1 bottle |
| FedEx U.S. express airbill | FedEx | NA | shipping return label Amount per deployable unit: 2 labels |
| Fisherbrand Premium Microcentrifuge Tubes: 1.5 mL | FisherSci | NC9386261 | sterile 1.5 mL microcentrifuge tubes Amount per deployable unit: 128 tubes |
| Forceps, #4a, very fine yet extra strong tips (33 mm), 4-3/8" (111 mm) long | Bioquip | 4523 | straight tip forceps Amount per deployable unit: 2 straight forceps |
| Forceps, #7, curved tips (13 mm), very fine points, 4-1/2" (114 mm) long | Bioquip | 4527 | curved tip forceps Amount per deployable unit: 2 curved forceps |
| Kimberly-Clark Professional Kimtech Science Kimwipes Delicate Task Wipers, 1-Ply | FisherSci | 06-666A | kimwipes (or other sterile wipe) Amount per deployable unit: 1 box |
| Laminated Illustrated field collection protocol | NA | NA | abbreviated protocol Amount per deployable unit: 1 protocol |
| Laminated list of materials | NA | NA | supply list Amount per deployable unit: 1 list |
| Lily Sugar 'N Cream The Original Solid Yarn, 2.5 oz, Medium 4 Gauge, 100% Cotton - Hot Pink - Machine Wash & Dry | Amazon | NA | pink yarn (to secure to forceps for visibility) Amount per deployable unit: 2 yards |
| Loupe by Bausch & Lomb, 10x Coddington Magnifier | Amazon | NA | hand lens Amount per deployable unit: 2 hand lenses |
| MyGift Clear Plastic 2-Tier Trays Craft Supply Storage Box/First Aid Carrying Case w/Top Handle & Latch Lock | Amazon | NA | supply storage box Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, L, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU14 | nitrile lab gloves (large) Amount per deployable unit: 1 box |
| Nitrile, Disposable Gloves, M, Powder-Free, 2.8 mil Palm Thickness | Grainger | 60NU13 | nitrile lab gloves (medium) Amount per deployable unit: 1 box |
| Qiagen, Inc. BUFFER ATL (200 ML) | Qiagen | 19076 | Qiagen ATL lysis buffer Amount per deployable unit: 180 µl/tube; 128 tubes |
| Rite In The Rain Weatherproof Side Spiral Notebook, Yellow Cover, Universal Page Pattern (No. 373-MX), 11 x 8.75 x 0.5 | Amazon | NA | weatherproof field notebook Amount per deployable unit: 1 notebook |
| Showgard Professional Stamp Tongs 6" 904 Round Tip Tweezers | Amazon | NA | 6" spade tip forceps Amount per deployable unit: 2 long spade forceps |
| Texwipe PolySat Pre-Wetted Wipers | FisherSci | 18-366-231 | alcohol wipes Amount per deployable unit: 100 wipes |
| Thermo Scientific CryoBoxes | FisherSci | 12-565-227 | 64 well microcentrifuge tubes collection/storage boxes Amount per deployable unit: 2 boxes |
| packing material Amount per deployable unit: as needed |
References
- Donald, H. M., Wood, C. W., Benowitz, K. M., Johnson, R. A., Drodie, E. D. Nondestructive sampling of insect DNA from defensive secretion. Molecular Ecology Resources. 12 (5), 856-860 (2012).
- Feinstein, J. DNA sequence from butterfly frass and exuviae. Conservation Genetics. 5 (1), 103-104 (2004).
- Hamm, C. A., Aggarwal, D., Landis, D. A. Evaluating the impact of non-lethal DNA sampling on two butterflies, Vanessa cardui and Satyrodes Eurydice. Journal of Insect Conservation. 14, 11-18 (2010).
- Holehouse, K. A., Hammond, R. L., Bourke, A. F. G. Non-lethal sampling of DNA from bumblebees for conservation genetics. Insectes Sociaux. 50 (3), 277-285 (2003).
- Lushai, G., et al. Application of molecular techniques to non-lethal tissue samples of endangered butterfly population (Parnassius apollo L.) in Norway for conservation management. Biological Conservation. 94 (1), 43-50 (2000).
- Monroe, E. M., Lynch, C., Soluk, D. A., Britten, H. B. Nonlethal tissue sampling techniques and microsatellite markers used for first report of genetic diversity in two populations of the endangered Somatochlora hineana (Odonata: Corduliidae). Annals of the Entomological Society of America. 103 (6), 1012-1017 (2010).
- Oi, C. A., López-Uribe, M. M., Cervini, M., Del Lama, M. A. Non-lethal method of DNA sampling in euglossine bees supported by mark-recapture experiments and microsatellite genotyping. Journal of Insect Conservation. 17 (5), 1071-1079 (2013).
- Scriven, J. J., Woodall, L. C., Goulson, D. Nondestructive DNA sampling from bumblebee feces. Molecular Ecology Resources. 13 (2), 225-229 (2013).
- Watts, P. C., Thompson, D. J., Daguet, C., Kemp, S. J. Exuviae as a reliable source of DNA for population-genetic analysis of odonates. Odonatologica. 34 (2), 183-187 (2005).
- Andrews, K., et al. All hands on deck: local ecological knowledge and expert volunteers contribute to the first delisting of a marine fish species under the Endangered Species Act. Citizen Science: Theory and Practice. 4 (1), 37 (2019).
- Buxton, A., Groombridge, J., Griffiths, G. Comparison of two citizen scientist methods for collecting pond water samples for environmental DNA studies. Citizen Science: Theory and Practice. 3 (2), 2 (2018).
- Granroth-Wilding, H., et al. Non-invasive genetic monitoring involving citizen science enables reconstruction of current pack dynamics in a re-establishing wolf population. BMC Ecology. 17 (1), 44 (2017).
- Qiagen, DNeasy Blood & Tissue Kit Quick Start Protocol. , Available from: https://www.qiagen.com/us/resources/download.aspx?id=63e22fd7-6eed-4bcb-8097-7ec77bcd4de6&lang=en (2016).
- Storer, C., Daniels, J., Xiao, L., Rossetti, K. Using noninvasive genetic sampling to survey rare butterfly populations. Insects. 10 (10), 311 (2019).
- Wagner, D. L., et al. Insect decline in the Anthropocene: Death by a thousand cuts. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 118 (2), 20239891 (2021).
- Montgomery, G. A., et al. Is the insect apocalypse upon us? How to find out. Biological Conservation. 241, 108327 (2020).
