Quaglia Membrana corioallantoica - uno strumento per la diagnosi fotodinamica e la terapia
Summary
La membrana corioallantoica (CAM) dell’embrione aviario è uno strumento molto utile e applicabile per varie aree di ricerca. Uno speciale modello ex ovo di quaglia giapponese CAM è adatto per l’indagine del trattamento fotodinamico.
Abstract
La membrana corioallantoica (CAM) di un embrione aviario è una sottile membrana extraembrionale che funziona come organo respiratorio primario. Le sue proprietà lo rendono un eccellente modello sperimentale in vivo per studiare l’angiogenesi, la crescita tumorale, i sistemi di somministrazione di farmaci o la diagnosi fotodinamica (PDD) e la terapia fotodinamica (PDT). Allo stesso tempo, questo modello affronta il requisito della sostituzione degli animali da esperimento con un’alternativa adeguata. L’embrione coltivato ex ovo consente una facile applicazione, accesso, monitoraggio e documentazione della sostanza. Il più frequentemente usato è pulcino CAM; tuttavia, questo articolo descrive i vantaggi del CAM di quaglia giapponese come modello a basso costo e ad alta produttività. Un altro vantaggio è lo sviluppo embrionale più breve, che consente un maggiore turnover sperimentale. L’idoneità della CAM di quaglia per PDD e PDT del cancro e delle infezioni microbiche è esplorata qui. Ad esempio, viene descritto l’uso del fotosensibilizzatore ipericina in combinazione con lipoproteine o nanoparticelle come sistema di consegna. È stato determinato il punteggio di danno dalle immagini in luce bianca e le variazioni dell’intensità di fluorescenza del tessuto CAM sotto luce violetta (405 nm), insieme all’analisi delle sezioni istologiche. La CAM di quaglia ha mostrato chiaramente l’effetto della PDT sulla vascolarizzazione e sul tessuto. Inoltre, si potrebbero osservare cambiamenti come emorragia capillare, trombosi, lisi di piccoli vasi e sanguinamento di vasi più grandi. La CAM di quaglia giapponese è un promettente modello in vivo per la diagnosi fotodinamica e la ricerca terapeutica, con applicazioni negli studi sull’angiogenesi tumorale e sulla terapia antivascolare e antimicrobica.
Introduction
Il modello della membrana corioallantoica (CAM) del pollo è ben noto e ampiamente utilizzato in varie aree di ricerca. È un organo extraembrionale riccamente vascolarizzato che fornisce lo scambio di gas e il trasporto di minerali1. Grazie alla trasparenza e all’accessibilità di questa membrana, i singoli vasi sanguigni e i loro cambiamenti strutturali possono essere osservati in tempo reale2. Nonostante i vantaggi, il pulcino CAM ha anche alcune limitazioni (ad esempio, strutture di allevamento più grandi, produzione di uova e consumo di mangime) che potrebbero essere evitate utilizzando altre specie aviarie. In questo protocollo, viene descritto un modello alternativo di CAM ex ovo utilizzando embrioni di quaglia giapponese (Coturnix japonica). A causa delle sue piccole dimensioni, consente l’uso di un numero molto maggiore di individui sperimentali rispetto al pollo CAM. Inoltre, lo sviluppo embrionale più breve di 16 giorni degli embrioni di quaglia è un altro vantaggio. I primi vasi più grandi su quaglia CAM compaiono il giorno embrionale (ED) 7. Questo può essere direttamente confrontato con lo sviluppo dell’embrione di pulcino (fasi 4-35); Tuttavia, le fasi successive dello sviluppo non sono più comparabili e richiedono meno tempo per l’embrione di quaglia3. Di interesse è la regolare comparsa di ramificazioni microvascolari simili a quelle delle CAM di pollo 4,5,6. La rapida maturazione sessuale, l’alta produzione di uova e l’allevamento a basso costo sono altri esempi che favoriscono l’uso di questo modello sperimentale7.
Un modello CAM aviario è spesso utilizzato negli studi di terapia fotodinamica (PDT)8. PDT è usato per trattare diverse forme di cancro (piccoli tumori localizzati) e altre malattie non oncologiche. Il suo principio è nella consegna di un farmaco fluorescente, un fotosensibilizzatore (PS), al tessuto danneggiato e la sua attivazione con la luce della lunghezza d’onda appropriata. Una PS prospettica utilizzata nella ricerca è l’ipericina, originariamente isolata dalla pianta medicinale erba di San Giovanni (Hypericum perforatum)9. I forti effetti fotosensibilizzanti di questo composto si basano sulle sue proprietà fotochimiche e fotofisiche. Questi sono caratterizzati da picchi di eccitazione di fluorescenza multipli nell’intervallo 400-600 nm, che inducono l’emissione di fluorescenza a circa 600 nm. I massimi di assorbimento dell’ipericina all’interno della banda spettrale sono nell’intervallo 540-590 nm e i massimi di fluorescenza sono nell’intervallo 590-640 nm9. Per ottenere questi effetti fotosensibilizzanti, l’ipericina viene eccitata dalla luce laser ad una lunghezza d’onda di 405 nm dopo somministrazione locale10. In presenza di luce, l’ipericina può mostrare effetti virucidi, antiproliferativi e citotossici11, mentre non vi è tossicità sistemica e viene rapidamente rilasciata dall’organismo. L’ipericina è una sostanza lipofila che forma aggregati non fluorescenti insolubili in acqua, motivo per cui diversi tipi di nanocarrier, come le nanoparticelle polimeriche 12,13 o le lipoproteine ad alta e bassa densità (HDL, LDL)14,15, vengono utilizzati per aiutare la sua consegna e penetrazione nelle cellule. Poiché la CAM è un sistema naturalmente immunodeficiente, le cellule tumorali possono essere impiantate direttamente sulla superficie della membrana. Il modello è anche adatto per registrare l’entità del danno vascolare indotto da PDT secondo un punteggio definito16,17. La luce di intensità inferiore rispetto alla PDT può essere utilizzata per la diagnosi fotodinamica (PDD). Il monitoraggio del tessuto sotto eccitazione viola La luce LED porta anche alla fotoattivazione dei fotosensibilizzatori18,19,20 che si traduce in un’emissione di luce fluorescente, ma non fornisce energia sufficiente per avviare una reazione PDT e danneggiare le cellule. Lo rende un buon strumento per la visualizzazione e la diagnosi del tumore o il monitoraggio della farmacocinetica dei PSs14,15 usati.
Questo articolo descrive la preparazione del test CAM di quaglia ex ovo con tassi di sopravvivenza superiori all’80%. Questa coltura ex ovo è stata applicata con successo in un gran numero di esperimenti.
Protocol
Representative Results
Discussion
Per una coltivazione ex ovo di successo, è importante seguire il protocollo di cui sopra. Inoltre, se le uova non vengono aperte con sufficiente attenzione o c’è umidità insufficiente durante la coltivazione, il sacco del tuorlo si attacca al guscio e spesso si rompe. L’inizio di una coltivazione ex ovo al momento di circa 60 ore di incubazione dell’uovo garantisce l’alto tasso di sopravvivenza degli embrioni, poiché sono già abbastanza grandi da sopravvivere alla manipolazione. Nelle fasi successi…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Il lavoro è stato sostenuto da VEGA 2/0042/21 e APVV 20-0129. Il contributo di V. Huntošová è il risultato dell’implementazione del progetto: Open scientific community for modern interdisciplinary research in medicine (Acronimo: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 supportato dal Programma Operativo Integrato Infrastruttura, finanziato dal FESR.
Materials
| 6-Well Cell Culture Plate | Sarstedt | 83.392 | Transparent polystyrene, sterile |
| CO2 Incubator ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapore | CCL-050B-8 | CO2 cell culture incubator |
| cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, USA | ||
| digital camera Canon EOS 6D II | Canon, Japan | ||
| diode laser 405 nm | Ocean Optics, USA | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimethyl sulfoxid |
| eosin | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| fine brush size 2 | Faber-Castell | 281802 | brush for CAM separation and manipulation |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| hematoxylin | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
| hypericin | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
| incubator Bios Midi | Bios Sedl any, Czech Republic |
Forced draught incubator for initial incubation | |
| incubator Memmert IF160 | Memmert, Germany | Forced air circulation incubator for CAM incubation | |
| Kaiser slimlite plano, LED light box | Kaiser, Germany | 2453 | Transilluminator |
| LED light 405 nm | custom made circular LED light | ||
| macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 | Canon, Japan | ||
| microscope Kapa 2000 | Kvant, Slovakia | optical microscope | |
| microtome Auxilab 508 | Auxilab, Spain | manual rotary microtome | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | parafin medium for tissue embedding |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate saline buffer |
| scissors Castroviejo | Orimed | OR66-108 | micro scissors for CAM separation |
| software ImageJ 1.53 | public domain | image processing and analysis program | |
| stock solution HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | high density lipoproteins |
| stock solution LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | low density lipoproteins |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles |
References
- Nowak-Sliwinska, P., van Beijnum, J. R., van Berkel, M., vanden Bergh, H., Griffioen, A. W. Vascular regrowth following photodynamic therapy in the chicken embryo chorioallantoic membrane. Angiogenesis. 13 (4), 281-292 (2010).
- van Leengoed, H. L. L. M., vander Veen, N., Versteeg, A. A. C., Ouellet, R., van Lier, J. E., Star, W. M. In-vivo photodynamic effects of phthalocyanines in a skin-fold observation chamber model: role of central metal ion and degree of sulfonation. Photochemistry Photobiology. 58 (4), 575-580 (1993).
- Ainsworth, S. J., Stanley, R. L., Evans, D. J. R. Developmental stages of the Japanese quail. Journal of Anatomy. 216 (1), 3 (2010).
- De Fouw, D. O., Rizzo, V. J., Steinfeld, R., Feinberg, R. N. Mapping of the microcirculation in the chick chorioallantoic membrane during normal angiogenesis. Microvascular Research. 38 (2), 136-147 (1989).
- Sandau, K., Kurz, H. Modelling of vascular growth processes: a stochastic biophysical approach to embryonic angiogenesis. Journal of Microscopy. 175 (3), 205-213 (1994).
- Kurz, H., Ambrosy, S., Wilting, J., Marmé, D., Christ, B. Proliferation pattern of capillary endothelial cells in chorioallantoic membrane development indicates local growth control, which is counteracted by vascular endothelial growth factor application. Developmental Dynamics. 203 (2), 174-186 (1995).
- Huss, D., Poynter, G., Lansford, R. Japanese quail (Coturnix japonica) as laboratory animal model. Lab Animal. 37 (11), 513-519 (2008).
- Gottfried, V., Lindenbaum, E. S., Kimel, S. The chick chorioallantoic membrane (CAM) as an in-vivo model for photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 12 (2), 204-207 (1992).
- Miškovský, P. Hypericin – a new antiviral and antitumor photosensitizer: mechanism of action and interaction with biological molecules. Current Drug Targets. 3 (1), 55-84 (2002).
- Čavarga, I., et al. Photodynamic effect of hypericin after topical application in the ex ovo quail chorioallantoic membrane model. Planta Medica. 80 (1), 56-62 (2014).
- Martinez-Poveda, B., Quesada, A. R., Medina, M. A. Hypericin in the dark inhibits key steps of angiogenesis in vitro. Europan Journal of Pharmacology. 516 (2), 97-103 (2005).
- Datta, S., et al. Unravelling the excellent chemical stability and bioavailability of solvent responsive curcumin-loaded 2-ethyl-2-oxazoline-grad-2-(4-dodecyloxyphenyl)- 2-oxazoline copolymer nanoparticles for drug delivery. Biomacromolecules. 19 (7), 2459-2471 (2018).
- Huntošová, V., et al. Alkyl Chain length in poly(2-oxazoline)-based amphiphilic gradient copolymers regulates the delivery of hydrophobic molecules: a case of the biodistribution and the photodynamic activity of the photosensitizer hypericin. Biomacromolecules. 22 (10), 4199-4216 (2021).
- Buríková, M., et al. Hypericin fluorescence kinetics in the presence of low density lipoproteins: study on quail CAM assay for topical delivery. General Physiology and Biophysic. 35 (4), 459-468 (2016).
- Lenkavska, L., et al. Benefits of hypericin transport and delivery by low- and high-density lipoproteins to cancer cells: From in vitro to ex ovo. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 25, 214-224 (2019).
- Rück, A., Böhmler, A., Steiner, R. PDT with TOOKAD studied in the chorioallantoic membrane of fertilized eggs. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 2 (1), 79-90 (2005).
- Gottfried, V., Davidi, R., Averbuj, C., Kimel, S. In vivo damage to chorioallantoic membrane blood vessels by porphycene-induced photodynamic therapy. Journal of Photochemistry and Photobiology, B: Biology. 30 (2-3), 115-121 (1995).
- Buzzá, H. H., Silva, L. V., Moriyama, L. T., Bagnato, V. S., Kurachi, C. Evaluation of vascular effect of Photodynamic Therapy in chorioallantoic membrane using different photosensitizers. Journal of Photochemistry and Photobiology B: Biology. 138, 1-7 (2014).
- Dougherty, T. J., et al. Photodynamic therapy. Journal of the National Cancer Institute. 90, 889-905 (1998).
- Xiang, L., et al. Real-time optoacoustic monitoring of vascular damage during photodynamic therapy treatment of tumor. Journal of Biomedical Optics. 12 (1), 01400-01408 (2007).
- Foty, R. A simple hanging drop cell culture protocol for generation of 3D spheroids. Journal of Visualized Experiments. (51), 2720 (2011).
- Abramoff, M. D., Magelhaes, P. J., Ram, S. J. Image Processing with ImageJ. Biophotonics International. 11 (7), 36-42 (2004).
- Chomczynski, P., Sacchi, N. Single-step method of RNA isolation by acid guanidium thiocyanate-phenol-chloroform extraction. Analytical Biochemistry. 162 (1), 156-159 (1987).
- Máčajová, M., Čavarga, I., Sýkorová, M., Valachovič, M., Novotná, V., Bilčík, B. Modulation of angiogenesis by topical application of leptin and high and low molecular heparin using the Japanese quail chorioallantoic membrane model. Saudi Journal of Biological Sciences. 27 (6), 1488-1493 (2020).
- Mangir, N., Dikici, S., Claeyssens, F., MacNeil, S. Using Ex Ovo chick chorioallantoic membrane (CAM) assay to evaluate the biocompatibility and angiogenic response to biomaterials. ACS Biomaterials Science Engineering. 5 (7), 3190-3200 (2019).
- Marshall, K. M., Kanczler, J. M., Oreffo, R. O. C. Evolving applications of the egg: chorioallantoic membrane assay and ex vivo organotypic culture of materials for bone tissue engineering. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-25 (2020).
- Merlos Rodrigo, M. A., et al. Extending the applicability of in ovo and ex ovo chicken chorioallantoic membrane assays to study cytostatic activity in neuroblastoma cells. Frontiers in Oncology. 11, 1-10 (2021).
- Meta, M., Kundeková, B., Bilčík, B., Máčajová, M. The effect of silicone ring application on CAM vasculature in Japanese Quail (Coturnix japonica). Proceedings of the Student Scientific Conference Faculty of Natural Sciences of Comenius University, Bratislava, Slovakia. , 385-390 (2019).
- Kohli, N., et al. Pre-screening the intrinsic angiogenic capacity of biomaterials in an optimised ex ovo chorioallantoic membrane model. Journal of Tissue Engineering. 11, 1-15 (2020).
- Kundeková, B., Máčajová, M., Meta, M., Čavarga, I., Bilčík, B. Chorioallantoic membrane models of various avian species differences and applications. Biology-Basel. 10 (4), 301 (2021).
- Parsons-Wingerter, P., Elliott, K. E., Clark, J. I., Farr, A. G. Fibroblast growth factor-2 selectively stimulates angiogenesis of small vessels in arterial tree. Arteriosclerosis, Thrombosis and Vascular Biology. 20 (5), 1250-1256 (2000).
- Buzzá, H. H., Zangirolami, A. C., Davis, A., Gómez-García, P. B., Kurachi, C. Fluorescence analysis of a tumor model in the chorioallantoic membrane used for the evaluation of different photosensitizers for photodynamic therapy. Photodiagnosis and Photodynamic Therapy. 19, 78-83 (2017).
