Membrana corioalantoidea de codorniz: una herramienta para el diagnóstico fotodinámico y la terapia
Summary
La membrana corioalantoidea (CAM) del embrión aviar es una herramienta muy útil y aplicable para diversas áreas de investigación. Un modelo especial ex ovo de codorniz japonesa CAM es adecuado para la investigación de tratamientos fotodinámicos.
Abstract
La membrana corioalantoidea (CAM) de un embrión aviar es una membrana delgada y extraembrionaria que funciona como un órgano respiratorio primario. Sus propiedades lo convierten en un excelente modelo experimental in vivo para estudiar angiogénesis, crecimiento tumoral, sistemas de administración de fármacos o diagnóstico fotodinámico (PDD) y terapia fotodinámica (PDT). Al mismo tiempo, este modelo aborda el requisito de reemplazar animales de experimentación con una alternativa adecuada. El embrión cultivado ex ovo permite una fácil aplicación, acceso, monitoreo y documentación de sustancias. El más utilizado es el chick CAM; sin embargo, este artículo describe las ventajas de la CAM de codorniz japonesa como un modelo de bajo costo y alto rendimiento. Otra ventaja es el desarrollo embrionario más corto, que permite una mayor rotación experimental. Aquí se explora la idoneidad de la CAM de codorniz para PDD y PDT de cáncer e infecciones microbianas. Como ejemplo, se describe el uso del fotosensibilizador hipericina en combinación con lipoproteínas o nanopartículas como sistema de administración. Se determinó la puntuación de daño de las imágenes en luz blanca y los cambios en la intensidad de fluorescencia del tejido CAM bajo luz violeta (405 nm), junto con el análisis de las secciones histológicas. La CAM de codorniz mostró claramente el efecto de la TFD en la vasculatura y el tejido. Además, se pueden observar cambios como hemorragia capilar, trombosis, lisis de vasos pequeños y sangrado de vasos más grandes. La CAM de codorniz japonesa es un modelo in vivo prometedor para el diagnóstico fotodinámico y la investigación terapéutica, con aplicaciones en estudios de angiogénesis tumoral, así como terapia antivascular y antimicrobiana.
Introduction
El modelo de membrana corioalantoidea (CAM) de pollo es bien conocido y ampliamente utilizado en diversas áreas de investigación. Es un órgano extraembrionario ricamente vascularizado que proporciona intercambio gaseoso y transporte mineral1. Debido a la transparencia y accesibilidad de esta membrana, los vasos sanguíneos individuales y sus cambios estructurales se pueden observar en tiempo real2. A pesar de las ventajas, la CAM de los pollitos también tiene algunas limitaciones (por ejemplo, instalaciones de cría más grandes, producción de huevos y consumo de alimento) que podrían evitarse mediante el uso de otras especies de aves. En este protocolo, se describe un modelo alternativo ex ovo CAM utilizando embrión de codorniz japonesa (Coturnix japonica). Debido a su pequeño tamaño, permite el uso de un número mucho mayor de individuos experimentales que el pollo CAM. Además, el desarrollo embrionario más corto de 16 días de los embriones de codorniz es otra ventaja. Los primeros vasos más grandes en la CAM de codorniz aparecen en el día embrionario (DE) 7. Esto se puede comparar directamente con el desarrollo del embrión de pollo (etapas 4-35); Sin embargo, las etapas posteriores de desarrollo ya no son comparables y requieren menos tiempo para el embrión de codorniz3. De interés es la ocurrencia regular de ramificación microvascular similar a la de las CAM de pollo 4,5,6. La rápida maduración sexual, la alta producción de huevos y la reproducción de bajo costo son otros ejemplos que favorecen el uso de este modelo experimental7.
Un modelo CAM aviar se utiliza a menudo en estudios de terapia fotodinámica (TFD)8. La TFD se utiliza para tratar varias formas de cáncer (tumores pequeños localizados) y otras enfermedades no oncológicas. Su principio está en la administración de un fármaco fluorescente, un fotosensibilizador (PS), al tejido dañado y su activación con luz de la longitud de onda adecuada. Una PS prospectiva utilizada en la investigación es la hipericina, originalmente aislada de la planta medicinal hierba de San Juan (Hypericum perforatum)9. Los fuertes efectos fotosensibilizantes de este compuesto se basan en sus propiedades fotoquímicas y fotofísicas. Estos se caracterizan por múltiples picos de excitación de fluorescencia en el rango de 400-600 nm, que inducen la emisión de fluorescencia a aproximadamente 600 nm. Los máximos de absorción de hipericina dentro de la banda espectral están en el rango de 540-590 nm, y los máximos de fluorescencia están en el rango de 590-640 nm9. Para lograr estos efectos fotosensibilizantes, la hipericina es excitada por la luz láser a una longitud de onda de 405 nm después de la administración local10. En presencia de luz, la hipericina puede exhibir efectos virucidas, antiproliferativos y citotóxicos11, mientras que no hay toxicidad sistémica y es liberada rápidamente del organismo. La hipericina es una sustancia lipofílica que forma agregados no fluorescentes insolubles en agua, por lo que se utilizan varios tipos de nanoportadores, como las nanopartículas poliméricas 12,13 o las lipoproteínas de alta y baja densidad (HDL, LDL)14,15, para ayudar a su entrega y penetración en las células. Dado que CAM es un sistema naturalmente inmunodeficiente, las células tumorales se pueden implantar directamente en la superficie de la membrana. El modelo también es adecuado para registrar la extensión del daño vascular inducido por TFD de acuerdo con una puntuación definida16,17. La luz de menor intensidad en comparación con la TFD se puede utilizar para el diagnóstico fotodinámico (PDD). El monitoreo del tejido bajo la luz LED de excitación violeta también conduce a la fotoactivación de fotosensibilizadores18,19,20 que resulta en una emisión de luz fluorescente, pero no proporciona suficiente energía para iniciar una reacción PDT y dañar las células. Lo convierte en una buena herramienta para la visualización y diagnóstico de tumores o para el monitoreo de la farmacocinética de las PSs utilizadas14,15.
Este artículo describe la preparación del ensayo de codorniz ex ovo CAM con tasas de supervivencia superiores al 80%. Este cultivo ex ovo se aplicó con éxito en un gran número de experimentos.
Protocol
Representative Results
Discussion
Para un cultivo ex ovo exitoso, es importante seguir el protocolo anterior. Además, si los huevos no se abren con suficiente cuidado o no hay humedad suficiente durante el cultivo, el saco vitelino se adhiere a la cáscara y, a menudo, se rompe. El inicio de un cultivo ex ovo en el momento de aproximadamente 60 h de incubación de huevos asegura la alta tasa de supervivencia de los embriones, ya que ya son lo suficientemente grandes como para sobrevivir a la manipulación. En las etapas posteriores del…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
El trabajo fue apoyado por VEGA 2/0042/21 y APVV 20-0129. La contribución de V. Huntošová es el resultado de la implementación del proyecto: Comunidad científica abierta para la investigación interdisciplinaria moderna en medicina (Acrónimo: OPENMED), ITMS2014+: 313011V455 apoyado por el Programa Operativo Infraestructura Integrada, financiado por el FEDER.
Materials
| 6-Well Cell Culture Plate | Sarstedt | 83.392 | Transparent polystyrene, sterile |
| CO2 Incubator ESCO CCL-0508 | ESCO, Singapore | CCL-050B-8 | CO2 cell culture incubator |
| cryocut Leica CM 1800 | Reichert-Jung, USA | ||
| digital camera Canon EOS 6D II | Canon, Japan | ||
| diode laser 405 nm | Ocean Optics, USA | ||
| DMSO | Sigma-Aldrich | 67-68-5 | dimethyl sulfoxid |
| eosin | Sigma-Aldrich | 15086-94-9 | |
| ethanol | Sigma-Aldrich | 64-17-5 | |
| fine brush size 2 | Faber-Castell | 281802 | brush for CAM separation and manipulation |
| glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | 111-30-8 | |
| hematoxylin | Sigma-Aldrich | 517-28-2 | |
| hypericin | Sigma-Aldrich | 84082-80-4 | |
| incubator Bios Midi | Bios Sedl any, Czech Republic |
Forced draught incubator for initial incubation | |
| incubator Memmert IF160 | Memmert, Germany | Forced air circulation incubator for CAM incubation | |
| Kaiser slimlite plano, LED light box | Kaiser, Germany | 2453 | Transilluminator |
| LED light 405 nm | custom made circular LED light | ||
| macro lens Canon MP- E 65 mm f/2.8 | Canon, Japan | ||
| microscope Kapa 2000 | Kvant, Slovakia | optical microscope | |
| microtome Auxilab 508 | Auxilab, Spain | manual rotary microtome | |
| paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | |
| Paraplast Plus | Sigma-Aldrich | P3683 | parafin medium for tissue embedding |
| PBS | Sigma-Aldrich | P4417 | Phosphate saline buffer |
| scissors Castroviejo | Orimed | OR66-108 | micro scissors for CAM separation |
| software ImageJ 1.53 | public domain | image processing and analysis program | |
| stock solution HDL | Sigma-Aldrich | 437641-10MG | high density lipoproteins |
| stock solution LDL | Sigma-Aldrich | 437644-10MG | low density lipoproteins |
| Tissue-Tek O.C.T. Compound | Sakura Finetek | 4583 | Optimal Cutting Temperature Compound 118 mL squeeze bottles |
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