Gebruik maken van micro-CT-scanning om parasitaire plant-gastheer interacties te analyseren

Summary

Micro-CT is een niet-destructief hulpmiddel dat plantstructuren in drie dimensies kan analyseren. Het huidige protocol beschrijft de monstervoorbereiding om micro-CT te gebruiken om de parasitaire plantstructuur en -functie te analyseren. Verschillende soorten worden gebruikt om de voordelen van deze methode te benadrukken in combinatie met specifieke preparaten.

Abstract

Micro-CT-scanning is een ingeburgerd hulpmiddel geworden bij het onderzoeken van de structuur en functie van planten. De niet-destructieve aard, gecombineerd met de mogelijkheid van driedimensionale visualisatie en virtuele secties, heeft nieuwe en steeds gedetailleerdere analyse van complexe plantenorganen mogelijk gemaakt. Interacties tussen planten, inclusief tussen parasitaire planten en hun gastheren, kunnen ook worden onderzocht. Monstervoorbereiding voor het scannen wordt echter cruciaal vanwege de interactie tussen deze planten, die vaak verschillen in weefselorganisatie en samenstelling. Bovendien moet rekening worden gehouden met de grote diversiteit van parasitaire bloeiende planten, variërend van sterk gereduceerde vegetatieve lichamen tot bomen, kruiden en struiken, tijdens de bemonstering, behandeling en bereiding van parasiet-gastheermateriaal. Hier worden twee verschillende benaderingen beschreven voor het introduceren van contrastoplossingen in de parasiet en / of waardplanten, met de nadruk op het analyseren van het haustorium. Dit orgaan bevordert de verbinding en communicatie tussen de twee planten. Volgens een eenvoudige benadering kunnen details van haustoriumweefselorganisatie driedimensionaal worden onderzocht, zoals hier wordt getoond voor eufytoïde, wijnstok- en maretakparasitaire soorten. Het selecteren van specifieke contrasterende middelen en toepassingsbenaderingen maakt ook gedetailleerde observatie van endoparasietverspreiding in het gastheerlichaam mogelijk en detectie van directe vaat-tot-vatverbinding tussen parasiet en gastheer, zoals hier getoond voor een obligate wortelparasiet. Het hier besproken protocol kan dus worden toegepast op de brede diversiteit van parasitaire bloeiende planten om het begrip van hun ontwikkeling, structuur en functioneren te bevorderen.

Introduction

Hoge resolutie X-ray microcomputed tomography (micro-CT) is een beeldvormingsmethode waarbij meerdere röntgenfoto’s (projecties) van een monster worden opgenomen vanuit verschillende kijkhoeken en later worden gebruikt om een virtuele reconstructie van het monster^{te bieden 1}. Dit virtuele object kan vervolgens worden geanalyseerd, gemanipuleerd en gesegmenteerd, waardoor niet-destructieve verkenning in drie dimensies^{mogelijk is 2}. Oorspronkelijk ontworpen voor medische analyses en later voor industriële toepassingen, biedt micro-CT ook het voordeel van het visualiseren van inwendige organen en weefsels zonder de noodzaak van invasieve procedures³. Net als andere vormen van beeldvorming werkt micro-CT met een afweging tussen het gezichtsveld en de pixelgrootte, wat betekent dat beeldvorming met hoge resolutie van grote monsters bijna onbereikbaar is⁴. Er wordt voortdurend vooruitgang geboekt in het gebruik van hoogenergetische röntgenbronnen (d.w.z. synchrotron) en secundaire optische vergroting, waardoor de kleinste resolutie minder dan 100 nm ^5,6 kan bereiken. Niettemin zijn langere scantijden nodig voor grote monsters, waardoor de kans op artefacten als gevolg van monsterbeweging of vervorming in de scanner toeneemt. Bovendien wordt micro-CT over het algemeen beperkt door natuurlijke dichtheidsvariaties in het monster en hoe het monster interageert met röntgenstralen. Hoewel een hogere röntgendosis het beste is voor het penetreren van dichtere monsters, is het minder efficiënt in het vastleggen van variaties in dichtheid binnen en tussen het monster en het omringende medium⁷. Aan de andere kant biedt een lagere röntgendosis minder penetratievermogen en vereist het vaak langere scantijden maar meer gevoeligheid bij dichtheidsdetectie⁷.

Deze beperkingen hebben het gebruik van microtomografie voor plantenwetenschappen lang belemmerd, aangezien de meeste plantenweefsels zijn samengesteld uit licht (niet-dicht) weefsel met een lage röntgenabsorptie⁸. De eerste toepassingen van micro-CT waren gericht op het in kaart brengen van wortelnetwerken binnen de bodemmatrix ^9,10. Later begonnen plantenstructuren met meer significante verschillen in weefseldichtheid, zoals hout, te worden onderzocht. Dit heeft onderzoek mogelijk gemaakt naar xyleemfunctionaliteit 11,12, ontwikkeling van complexe weefselorganisaties 13,14 en interacties tussen planten 15,16,17. De analyse van zacht en homogeen weefsel wordt wijdverspreid als gevolg van contrastmiddelen, die nu standaardprocedure zijn in preparaten voor micro-CT-scans van plantenmonsters. Protocollen voor contrastintroductie kunnen echter verschillende resultaten hebben, afhankelijk van het monstervolume, de structurele eigenschappen en het type oplossing dat wordt gebruikt⁸. Idealiter zou het contrastmiddel het onderscheid tussen verschillende weefsels moeten verbeteren, evaluatie van de weefsel- / orgaanfunctionaliteit mogelijk moeten maken en / of biochemische informatie over een weefsel moeten verstrekken¹⁸. Daarom worden adequate monsterbehandeling, voorbereiding en montage vóór het scannen cruciaal voor elke micro-CT-analyse.

Micro-CT van de parasitaire plant haustorium
Parasitaire bloeiende planten vertegenwoordigen een afzonderlijke functionele groep angiospermen die worden gekenmerkt door een orgaan dat bekend staat als haustorium¹⁹. Dit meercellige orgaan, een ontwikkelingshybride tussen een gemodificeerde stengel en een wortel, werkt in op de hechting, penetratie en het contact van de gastheer door een parasiet²⁰. Om deze reden wordt het haustorium beschouwd als “de belichaming van het idee van parasitisme onder planten”²¹. Een gedetailleerd begrip van de ontwikkeling, structuur en werking van dit orgaan is cruciaal voor parasitaire plantenecologie, evolutie en managementstudies. Niettemin belemmeren de algehele complexiteit van parasitaire planten en de sterk gewijzigde structuur en haustoria vaak een gedetailleerde analyse en vergelijking. Haustoriumverbindingen zijn meestal ook uitgebreid en niet homogeen in weefsel- en celverdeling (figuur 1). In deze context, terwijl het werken met kleine weefselfragmenten eenvoudigere manipulatie en een hogere resolutie mogelijk maakt, kan dit leiden tot onjuiste conclusies over de driedimensionale architectuur van complexe structuren, zoals het parasitaire plantenhaustorium.

Hoewel er een uitgebreide literatuur bestaat over de anatomie en ultrastructuur van haustorium voor de meeste parasitaire plantensoorten, blijft de driedimensionale organisatie en de ruimtelijke relatie tussen parasiet en gastheerweefsel slecht onderzocht¹⁷. In een recent werk van Masumoto et ^al.22 werden meer dan 300 seriële halfdunne microtoomsecties in beeld gebracht en gereconstrueerd tot een driedimensionaal virtueel object dat het haustorium van twee parasietsoorten vertegenwoordigt. Het uitstekende detailniveau van deze methode biedt ongekende inzichten in de cellulaire en anatomische 3D-structuur van het haustorium. Een dergelijke tijdrovende techniek zou echter een soortgelijke analyse bij parasieten met uitgebreidere haustoriumverbindingen verbieden. Het gebruik van micro-CT komt naar voren als een uitstekend hulpmiddel voor driedimensionale analyse van complexe en vaak omvangrijke haustoria van parasitaire planten. Hoewel het geen vervanging is voor gedetailleerde anatomische secties en andere complementaire vormen van microscopieanalyses^17,23, kunnen resultaten verkregen via micro-CT-scanning, vooral voor grote monsters, ook dienen als een gids voor het sturen van de subbemonstering van kleinere segmenten, die vervolgens kunnen worden geanalyseerd met behulp van andere hulpmiddelen, zoals confocale en elektronenmicroscopie^, of opnieuw geanalyseerd met micro-CT-systemen met hoge resolutie.

Figuur 1: Parasitaire planten van verschillende functionele groepen die in dit protocol worden gebruikt. Eufytoïde parasiet Pyrularia pubera (A), endoparasiet Viscum minimum (B) met groene vruchten (onderbroken zwarte cirkel), parasitaire wijnstok Cuscuta americana (C), maretak Struthanthus martianus (D), obligate wortelparasiet Scybalium fungiforme (E). Segmenten van de gastheerwortel (Hr) of stengel (Hs) vergemakkelijken de toepassing van contrast in de parasiet haustorium (P). De aanwezigheid van parasiet moeder wortel / stengel (pijlen) in het monster maakt analyse van haustorium vat organisatie mogelijk. Rechthoeken geven segmenten van het monster aan die voor de analyse worden gebruikt. Schaalstaven = 2 cm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

Naarmate micro-CT een steeds populairdere techniek wordt in de plantenwetenschappen, zijn er handleidingen, protocollen en literatuur over het scannen van monsters, driedimensionale reconstructie, segmentatie en analyse ^3,10,24. Deze stappen zullen hier dus niet worden besproken. Zoals met elke verbeeldingstechniek, zijn de juiste behandeling en montage van monsters een fundamentele, hoewel het vaak een over het hoofd geziene procedure is. Om deze reden richt dit protocol zich op de voorbereiding van haustoriummonsters voor micro-CT-scanning. Meer specifiek beschrijft dit protocol twee benaderingen voor het introduceren van contrastmiddelen in haustoriummonsters om de visualisatie van verschillende weefsels en celtypen in het haustorium te verbeteren, om de detectie van parasitair weefsel in de gastheerwortel / stam te vergemakkelijken en om parasiet-gastheer vasculaire verbindingen in drie dimensies te analyseren. De hier beschreven preparaten kunnen ook worden aangepast aan de analyse van andere plantstructuren.

Vijf soorten werden gebruikt om het gemak van het hier beschreven protocol beter te illustreren. Elke soort vertegenwoordigt een van de vijf functionele groepen van parasitaire bloeiende planten, waardoor specifieke punten met betrekking tot de functionaliteit van elke groep worden aangepakt. Pyrularia pubera (Santalaceae) werd gekozen om eufytoïde parasieten te vertegenwoordigen, die in de grond ontkiemen en meerdere haustoria vormen die de parasiet verbinden met de wortels van zijn gastheren²⁵. De haustoria die door deze planten worden gecreëerd, zijn vaak ijl en gemakkelijk los te scheuren van de gastheer²⁶ (figuur 1A), waardoor een delicater behandelingsproces nodig is. Endoparasieten worden hier vertegenwoordigd door Viscum minimum (Viscaceae). Soorten in deze functionele groep zijn slechts gedurende korte perioden zichtbaar buiten het lichaam van hun gastheren (figuur 1B) en leven het grootste deel van hun levenscyclus als aanzienlijk gereduceerde en myceliale strengen cellen ingebed in gastheerweefsels²⁵. Een derde functionele groep bestaat uit parasitaire wijnstokken, die op de grond ontkiemen maar slechts rudimentaire wortels vormen, afhankelijk van meerdere haustoria die zich hechten aan de stengels van waardplanten²⁵ (figuur 1C). Hier wordt deze functionele groep vertegenwoordigd door Cuscuta americana (Convolvulaceae). In tegenstelling tot parasitaire wijnstokken ontkiemen maretak direct op de takken van hun waardplanten en ontwikkelen ze meerdere of solitaire haustoria²⁵. De soort die is gekozen om deze functionele groep te illustreren is Struthanthus martianus (Loranthaceae), die verschillende verbindingen vormt met de gastheertak (figuur 1D). Analyse van solitaire maretak haustoria met behulp van een combinatie van micro-CT en lichtmicroscopie is te vinden in Teixeira-Costa &; Ceccantini¹⁷. Ten slotte omvatten obligate wortelparasieten soorten die op de grond ontkiemen en de wortels van waardplanten binnendringen, waarvan ze volledig afhankelijk zijn vanaf de vroegste groeistadia²⁵. Deze planten worden hier vertegenwoordigd door Scybalium fungiforme (Balanophoraceae), die grote knolachtige haustoria produceren (figuur 1E).

Alle plantenmonsters die in dit protocol werden gebruikt, werden gefixeerd in een 70% formaline-azijnzuuralcohol (FAA 70). De fixatie op bemonstering is cruciaal voor het behoud van plantenweefsels, vooral als latere anatomische analyses nodig zijn. In het geval van parasitaire plantenhaustorium is fixatie ook essentieel, omdat dit orgaan vaak voornamelijk bestaat uit niet-gelignificeerde parenchymcellen²⁰. Gedetailleerde protocollen voor de fixatie van plantenweefsel, inclusief de bereiding van fixatieve oplossingen, zijn elders te vinden²⁷. Aan de andere kant kunnen fixatieven in meer of mindere mate veranderingen in de fysische en chemische eigenschappen van een monster veroorzaken, waardoor het ongeschikt wordt voor specifieke biomechanische en histochemische analyses. Zo kunnen verse monsters, d.w.z. niet-gefixeerd materiaal dat onmiddellijk voor de bereiding wordt verzameld, ook met dit protocol worden gebruikt. Details over het omgaan met nieuwe monsters en suggesties voor het oplossen van problemen met gefixeerd materiaal vindt u in de discussiesectie.

Protocol

1. Selectie van parasitaire plantenmonsters Verzamel het volledige parasitaire plantenhaustorium, inclusief de aangehechte gastheerstam / wortel en segmenten van zowel proximale als distale uiteinden van het geparasiteerde gastheerorgaan; De ideale lengte van elk segment is gelijk aan het dubbele van de diameter van het Haustorium.OPMERKING: Neem voor laterale haustoria een deel van de parasietmoederstam/-wortel op waaruit het haustorium is gevormd (figuur 1A,B,D</stron…

Representative Results

Het haustorium van parasitaire planten is een complex orgaan dat bestaat uit verschillende weefsels en celtypen die zich verstrengelen en verbinden met de weefsels van een andere plant, gebruikt als gastheer20. Micro-CT-scanning kan worden gebruikt om deze complexe structuur op een niet-destructieve en driedimensionale manier beter te begrijpen bij het analyseren van zowel kleine (Figuur 1A-C) als grote (Figuur 1D, E</str…

Discussion

Het gebruik van oplossingen voor zware metalen om het contrast van plantenweefsel te verbeteren, is een cruciale stap geworden in de monstervoorbereiding voor micro-CT-analyse. Verschillende verbindingen die algemeen beschikbaar zijn in laboratoria voor micromorfologie van planten zijn getest door Staedler et al., die aanbevelen fosfotungstaat te gebruiken als het meest effectieve middel in penetrerende monsters en de contrastindex⁸ te verhogen. De resultaten die hier zijn verkregen bij de analyse…

Materials

3D X-ray microscope (XRM) system		Zeiss Versa 620	used to scan Pyrularia pubera
3D X-ray microscope + A2:D22	Zeiss	Versa 620	Used for scanning the species P. pubera
CT-Pro 3D software	Nikon	version XT 3.1.11	Used for three-dimensional reconstruction of scans
CT-Vox software	Bruker	version 3.3.1	Used for analyses and acquisition of images and videos
Dragonfly software	Object Research Systems – ORS	version	Used for analyses and acquisition of images and videos
Glass vials	Glass Vials Inc. SE	V2708C-FM-SP	Sold by VWR – USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi
Inspect-X	Zeiss	version XT 3.1.11	Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system
Iodine solution 0.0282 N	WR Chemicals BDH	BDH7422-1	Sold by VWR – USA
Lead Nitrate II PA 500 g	Vetec	361.08	Sold by SPLab
Microtomography scanner	Bruker	Skyscan1176	Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme
Microtomography scanner	Nikon	X-Tek HMXST225	Used for scanning the species V. minimum
NRecon software	Bruker	version 1.0.0	Used for three-dimensional reconstruction
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	101410-756	Sold by VWR – USA
Plastic film (Parafilm)	Heathrow Scientific	PM996	Sold by VWR – USA
Plastic IV bag 500 mL	Taylor	3478	Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude
PVC tubing 3/4''	Nalge Nunc International	SC63013-164	Sold by VWR – USA
Scanning system		Nikon X-Tek HMXST225	used to scan Viscum minimum
Scanning system		Bruker Skyscan 1176	used to scan C. americana
Scout-and-ScanTM software	Zeiss	version 16	Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans
Three-way valve	ToToT	DMTWVS-5	Sold by Amazon USA
Two-part syringe	HSW Henke-Ject	4850001000	Used without the plunger
Vacuum chamber	Binder	80080-434	Sold by VWR – USA; includes pump and connecting tubes
VG Studio Max software	Volume Graphics	version 3.0	Used for analyses and acquisition of images and videos