Aprovechamiento de la micro-tomografía computarizada para analizar las interacciones parásitas planta-huésped

Summary

Micro-CT es una herramienta no destructiva que puede analizar estructuras de plantas en tres dimensiones. El presente protocolo describe la preparación de la muestra para aprovechar la micro-TC para analizar la estructura y función de las plantas parásitas. Se utilizan diferentes especies para resaltar las ventajas de este método cuando se combina con preparaciones específicas.

Abstract

La micro-tomografía computarizada se ha convertido en una herramienta establecida en la investigación de la estructura y función de la planta. Su naturaleza no destructiva, combinada con la posibilidad de visualización tridimensional y seccionamiento virtual, ha permitido un análisis novedoso y cada vez más detallado de órganos vegetales complejos. También se pueden explorar las interacciones entre las plantas, incluso entre las plantas parásitas y sus huéspedes. Sin embargo, la preparación de la muestra antes del escaneo se vuelve crucial debido a la interacción entre estas plantas, que a menudo difieren en la organización y composición del tejido. Además, la amplia diversidad de plantas con flores parásitas, que van desde cuerpos vegetativos altamente reducidos hasta árboles, hierbas y arbustos, debe considerarse durante el muestreo, tratamiento y preparación del material parásito-huésped. Aquí se describen dos enfoques diferentes para introducir soluciones de contraste en el parásito y / o plantas huésped, centrándose en el análisis del haustorio. Este órgano promueve la conexión y la comunicación entre las dos plantas. Siguiendo un enfoque simple, los detalles de la organización del tejido del haustorio se pueden explorar tridimensionalmente, como se muestra aquí para las especies parásitas eufitoides, vid y muérdago. La selección de agentes contrastantes específicos y los enfoques de aplicación también permiten la observación detallada de la propagación del endoparásito dentro del cuerpo del huésped y la detección de la conexión directa de vaso a vaso entre el parásito y el huésped, como se muestra aquí para un parásito de raíz obligado. Por lo tanto, el protocolo discutido aquí se puede aplicar a la amplia diversidad de plantas con flores parásitas para avanzar en la comprensión de su desarrollo, estructura y funcionamiento.

Introduction

La tomografía microcomputarizada de rayos X de alta resolución (micro-TC) es un método de imagen en el que se registran múltiples radiografías (proyecciones) de una muestra desde diferentes ángulos de visión y luego se utilizan para proporcionar una reconstrucción virtual de la muestra¹. Este objeto virtual puede ser analizado, manipulado y segmentado, permitiendo la exploración no destructiva en tres dimensiones². Inicialmente diseñado para análisis médicos y más tarde para aplicaciones industriales, el micro-CT también ofrece la ventaja de visualizar órganos y tejidos internos sin necesidad de procedimientos invasivos³. Al igual que otras formas de imagen, la micro-TC funciona con una compensación entre el campo de visión y el tamaño de píxel, lo que significa que las imágenes de alta resolución de muestras grandes son casi inalcanzables⁴. Constantemente se están realizando avances en el uso de fuentes de rayos X de alta energía (es decir, sincrotrón) y aumento óptico secundario, lo que permite que la resolución más pequeña alcance menos de 100 nm ^5,6. Sin embargo, se necesitan tiempos de escaneo más largos para muestras grandes, lo que aumenta la posibilidad de artefactos debido al movimiento de la muestra o la deformación dentro del escáner. Además, la micro-TC generalmente está limitada por las variaciones naturales de densidad dentro de la muestra y cómo la muestra interactúa con los rayos X. Si bien una dosis de rayos X más alta es mejor para penetrar muestras más densas, es menos eficiente para capturar variaciones en la densidad dentro y entre la muestra y su medio circundante⁷. Por otro lado, una dosis de rayos X más baja ofrece menos poder de penetración y a menudo requiere tiempos de escaneo más largos pero más sensibilidad en la detección de densidad⁷.

Estas restricciones han obstaculizado durante mucho tiempo el uso de la microtomografía para las ciencias de las plantas, dado que la mayoría de los tejidos vegetales están compuestos de tejido ligero (no denso) con baja absorción de rayos X⁸. Las primeras aplicaciones de micro-CT se centraron en el mapeo de redes radiculares dentro de la matriz del suelo ^9,10. Más tarde, las estructuras vegetales con diferencias más significativas en la densidad del tejido, como la madera, comenzaron a explorarse. Esto ha permitido investigar la funcionalidad del xilema 11,12, el desarrollo de organizaciones tisulares complejas^13,14 y las interacciones entre plantas^15,16,17. El análisis de tejido blando y homogéneo se está generalizando debido a los agentes de contraste, que ahora son un procedimiento estándar en las preparaciones para la micro-tomografía computarizada de muestras de plantas. Sin embargo, los protocolos para la introducción de contraste pueden tener resultados diferentes dependiendo del volumen de la muestra, las propiedades estructurales y el tipo de solución utilizada⁸. Idealmente, el agente de contraste debe mejorar la distinción entre diferentes tejidos, permitir la evaluación de la funcionalidad del tejido/órgano y/o proporcionar información bioquímica sobre un tejido¹⁸. Por lo tanto, el tratamiento adecuado de la muestra, la preparación y el montaje antes de la exploración se vuelven cruciales para cualquier análisis de micro-TC.

Micro-CT de la planta parásita haustorium
Las plantas con flores parásitas representan un grupo funcional distinto de angiospermas caracterizadas por un órgano conocido como haustorio¹⁹. Este órgano multicelular, un híbrido de desarrollo entre un tallo modificado y una raíz, actúa sobre la unión, penetración y contacto del huésped por un parásito²⁰. Por esta razón, se considera que el haustorio “encarna la idea misma del parasitismo entre las plantas”²¹. Una comprensión detallada del desarrollo, la estructura y el funcionamiento de este órgano es crucial para la ecología, evolución y manejo de plantas parásitas. Sin embargo, la complejidad general de las plantas parásitas y la estructura y los haustorios altamente modificados a menudo dificultan el análisis detallado y la comparación. Las conexiones del haustorio también suelen ser extensas y no homogéneas en la distribución de tejidos y células (Figura 1). En este contexto, si bien trabajar con pequeños fragmentos de tejido permite una manipulación más fácil y una mayor resolución, puede llevar a conclusiones erróneas sobre la arquitectura tridimensional de estructuras complejas, como el haustorio de plantas parásitas.

Aunque existe una vasta literatura sobre anatomía y ultraestructura haustorium para la mayoría de las especies de plantas parásitas, la organización tridimensional y la relación espacial entre los tejidos del parásito y del huésped sigue siendo poco explorada¹⁷. En un trabajo reciente de Masumoto et ^al.22, más de 300 secciones seriales de microtomos semifinos fueron fotografiadas y reconstruidas en un objeto virtual tridimensional que representa el haustorio de dos especies de parásitos. El excelente nivel de detalle de este método proporciona información sin precedentes sobre la estructura 3D celular y anatómica del haustorio. Sin embargo, una técnica tan lenta prohibiría un análisis similar en parásitos con conexiones haustorias más extensas. El uso de micro-CT surge como una excelente herramienta para el análisis tridimensional de haustorios complejos y a menudo voluminosos de plantas parásitas. Aunque no es un sustituto de la sección anatómica detallada y otras formas complementarias de análisis microscópicos^17,23, los resultados obtenidos a través de la micro-TC, especialmente para muestras grandes, también pueden servir como guía para dirigir el submuestreo de segmentos más pequeños, que luego pueden ser analizados utilizando otras herramientas, como microscopía confocal y electrónica^, o re-analizados con sistemas de micro-TC de alta resolución.

Figura 1: Plantas parásitas de diferentes grupos funcionales utilizadas en este protocolo. Parásito eufitoide Pyrularia pubera (A), endoparásito Viscum minimum (B) con frutos verdes (círculo negro discontinuo), vid parásita Cuscuta americana (C), muérdago Struthanthus martianus (D), parásito de raíz obligada Scybalium fungiforme (E). Los segmentos de la raíz del huésped (Hr) o tallo (Hs) facilitan la aplicación de contraste en el haustorio parásito (P). La presencia de raíz madre del parásito (flechas) en la muestra permite el análisis de la organización del vaso haustorio. Los rectángulos indican segmentos de la muestra utilizados para el análisis. Barras de escala = 2 cm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

A medida que la micro-TC se convierte en una técnica cada vez más popular en las ciencias de las plantas, existen guías, protocolos y literatura que tratan sobre el escaneo de muestras, la reconstrucción tridimensional, la segmentación y el análisis ^3,10,24. Por lo tanto, estos pasos no se discutirán aquí. Al igual que con cualquier técnica de imaginación, el tratamiento adecuado y el montaje de muestras son fundamentales, aunque a menudo se pasa por alto. Por esta razón, este protocolo se centra en la preparación de muestras de haustorio para micro-TC. Más específicamente, este protocolo describe dos enfoques para introducir agentes de contraste en muestras de haustorio para mejorar la visualización de diferentes tejidos y tipos de células en el haustorio, para facilitar la detección de tejido parásito dentro de la raíz / tallo del huésped y para analizar las conexiones vasculares parásito-huésped en tres dimensiones. Las preparaciones descritas aquí también se pueden adaptar al análisis de otras estructuras vegetales.

Se utilizaron cinco especies para ilustrar mejor la conveniencia del protocolo descrito aquí. Cada especie representa uno de los cinco grupos funcionales de plantas con flores parásitas, abordando así puntos específicos relacionados con la funcionalidad de cada grupo. Pyrularia pubera (Santalaceae) fue elegida para representar parásitos eufitoides, que germinan en el suelo y forman múltiples haustorios que conectan el parásito con las raíces de sus huéspedes²⁵. Los haustorios creados por estas plantas son a menudo tenues y fácilmente desgarrados del huésped²⁶ (Figura 1A), lo que requiere un proceso de manipulación más delicado. Los endoparásitos están representados aquí por Viscum minimum (Viscaceae). Las especies de este grupo funcional sólo son visibles fuera del cuerpo de sus huéspedes durante períodos cortos (Figura 1B) y viven la mayor parte de sus ciclos de vida como hebras significativamente reducidas y miceliales de células incrustadas dentro de los tejidos del huésped²⁵. Un tercer grupo funcional comprende enredaderas parásitas, que germinan en el suelo pero forman solo raíces rudimentarias, confiando en múltiples haustorios que se adhieren a los tallos de las plantas hospedadoras²⁵ (Figura 1C). Aquí, este grupo funcional está representado por Cuscuta americana (Convolvulaceae). Contrariamente a las vides parásitas, el muérdago germina directamente sobre las ramas de sus plantas hospederas y se desarrolla en haustorios múltiples o solitarios²⁵. La especie elegida para ilustrar este grupo funcional es Struthanthus martianus (Loranthaceae), que forma varias conexiones con la rama huésped (Figura 1D). El análisis de haustorios de muérdago solitario utilizando una combinación de micro-TC y microscopía óptica se puede encontrar en Teixeira-Costa & Ceccantini¹⁷. Finalmente, los parásitos de raíces obligadas comprenden especies que germinan en el suelo y penetran en las raíces de las plantas huésped, de las cuales son totalmente dependientes desde las primeras etapas de crecimiento²⁵. Estas plantas están representadas aquí por Scybalium fungiforme (Balanophoraceae), que producen grandes haustorios similares a tubérculos (Figura 1E).

Todas las muestras de plantas utilizadas en este protocolo se fijaron en un alcohol de ácido acético formalina al 70% (FAA 70). La fijación en el muestreo es crucial para preservar los tejidos vegetales, especialmente si se necesitan análisis anatómicos posteriores. En el caso del haustorio vegetal parásito, la fijación también es esencial, ya que este órgano a menudo está compuesto principalmente por células del parénquima no lignificadas²⁰. Los protocolos detallados para la fijación de tejidos vegetales, incluida la preparación de soluciones fijadoras, se pueden encontrar en otra parte²⁷. Por otro lado, en mayor o menor grado, los fijadores pueden causar alteraciones de las propiedades físicas y químicas de una muestra, haciéndola inadecuada para análisis biomecánicos e histoquímicos específicos. Por lo tanto, las muestras frescas, es decir, el material no fijado recogido inmediatamente antes de la preparación, también se pueden utilizar con este protocolo. Los detalles sobre cómo manejar muestras frescas y sugerencias de solución de problemas para material fijo se proporcionan en la sección de discusión.

Protocol

1. Selección de muestras de plantas parásitas Recolectar todo el haustorio de la planta parásita, incluido el tallo / raíz del huésped adjunto y los segmentos de los extremos proximal y distal del órgano huésped parasitado; La longitud ideal de cada segmento equivale al doble del diámetro del haustorio.NOTA: Para los haustorios laterales, incluya parte del tallo/raíz madre del parásito a partir del cual se formó el haustorio (Figura 1A, B, D<…

Representative Results

El haustorio de plantas parásitas es un órgano complejo que comprende diferentes tejidos y tipos celulares que se entrelazan y conectan con los tejidos de otra planta, utilizada como huésped20. La micro-tomografía computarizada se puede aprovechar para comprender mejor esta compleja estructura de una manera no destructiva y tridimensional cuando se analizan haustorios pequeños (Figura 1A-C) y grandes (Figura 1D, E</s…

Discussion

El uso de soluciones de metales pesados para mejorar el contraste del tejido vegetal se ha convertido en un paso crucial en la preparación de muestras para el análisis de micro-TC. Varios compuestos comúnmente disponibles en los laboratorios de micromorfología vegetal han sido probados por Staedler et al., quienes recomiendan el uso de fosfotungato como el agente más efectivo para penetrar muestras y aumentar el índice de contraste⁸. Los resultados obtenidos aquí en el análisis del haustor…

Materials

3D X-ray microscope (XRM) system		Zeiss Versa 620	used to scan Pyrularia pubera
3D X-ray microscope + A2:D22	Zeiss	Versa 620	Used for scanning the species P. pubera
CT-Pro 3D software	Nikon	version XT 3.1.11	Used for three-dimensional reconstruction of scans
CT-Vox software	Bruker	version 3.3.1	Used for analyses and acquisition of images and videos
Dragonfly software	Object Research Systems – ORS	version	Used for analyses and acquisition of images and videos
Glass vials	Glass Vials Inc. SE	V2708C-FM-SP	Sold by VWR – USA; make sure that vials are able to withstand vacuum at ca. 10 psi
Inspect-X	Zeiss	version XT 3.1.11	Used for controlling the Nikon X-Tek HMXST225 system
Iodine solution 0.0282 N	WR Chemicals BDH	BDH7422-1	Sold by VWR – USA
Lead Nitrate II PA 500 g	Vetec	361.08	Sold by SPLab
Microtomography scanner	Bruker	Skyscan1176	Used for scanning the species C. americana, S. martianus, and S. fungiforme
Microtomography scanner	Nikon	X-Tek HMXST225	Used for scanning the species V. minimum
NRecon software	Bruker	version 1.0.0	Used for three-dimensional reconstruction
Phosphotungstic acid hydrate 3% in aqueous solution	Electron Microscopy Sciences	101410-756	Sold by VWR – USA
Plastic film (Parafilm)	Heathrow Scientific	PM996	Sold by VWR – USA
Plastic IV bag 500 mL	Taylor	3478	Sold by Fibra Cirurgica Produtos para Saude
PVC tubing 3/4''	Nalge Nunc International	SC63013-164	Sold by VWR – USA
Scanning system		Nikon X-Tek HMXST225	used to scan Viscum minimum
Scanning system		Bruker Skyscan 1176	used to scan C. americana
Scout-and-ScanTM software	Zeiss	version 16	Used for controlling the Zeiss Versa 620 system and for three-dimensional reconstruction of scans
Three-way valve	ToToT	DMTWVS-5	Sold by Amazon USA
Two-part syringe	HSW Henke-Ject	4850001000	Used without the plunger
Vacuum chamber	Binder	80080-434	Sold by VWR – USA; includes pump and connecting tubes
VG Studio Max software	Volume Graphics	version 3.0	Used for analyses and acquisition of images and videos