Här beskrivs en metod för att göra växtvävnader transparenta samtidigt som stabiliteten hos fluorescerande proteiner bibehålls. Denna teknik underlättar djup avbildning av rensade växt vävnader utan fysisk avsnitting.
Det är utmanande att direkt observera den inre strukturen hos flerskiktiga och ogenomskinliga växtprover, utan dissekering, under ett mikroskop. Dessutom hindrar autofluorescens som tillskrivs klorofyll observationen av fluorescerande proteiner i växter. Under lång tid har olika clearingreagenser använts för att göra växter transparenta. Konventionella clearingreagenser minskar dock fluorescerande signaler; därför har det inte varit möjligt att observera cellulära och intracellulära strukturer med fluorescerande proteiner. Reagenser utvecklades som kan rensa växtvävnader genom att ta bort klorofyll samtidigt som fluorescerande protein stabilitet upprätthålls. Ett detaljerat protokoll finns här för optisk röjning av växtvävnader med hjälp av clearingreagenser, ClearSee (CS) eller ClearSeeAlpha (CSA). Beredningen av rensade växtvävnader innebär tre steg: fixering, tvättning och clearing. Fixering är ett avgörande steg för att upprätthålla cellulära strukturer och intracellulär stabilitet av fluorescerande proteiner. Inkubationstiden för röjning beror på vävnadstyp och art. I Arabidopsis thaliana var den tid som krävdes för röjning med CS 4 dagar för löv och rötter, 7 dagar för plantor och 1 månad för pistiller. CS krävde också en relativt kort tid på 4 dagar för att göra de gametofytiska bladen av Physcomitrium patens transparenta. Pistiller i tobak och toreni producerade däremot brunt pigment på grund av oxidation under CS-behandlingen. CSA minskade det bruna pigmentet genom att förhindra oxidation och kunde göra tobaks- och toreniapiss transparenta, även om det tog relativt lång tid (1 eller 2 månader). CS och CSA var också kompatibla med färgning med kemiska färgämnen, såsom DAPI (4′,6-diamidino-2-fenylindole) och Hoechst 33342 för DNA och Calcofluor White, SR2200 och Direct Red 23 för cellväggen. Denna metod kan vara användbar för hela anläggningen imaging att avslöja intakt morfologi, utvecklingsprocesser, växt-mikrob interaktioner och nematod infektioner.
Visualisering av cellulära strukturer och lokalisering av proteiner i levande organismer är viktigt för att klargöra deras funktioner in vivo. Men eftersom den levande kroppen inte är transparent är det utmanande att observera den inre strukturen hos levande organismer utan dissekering. Särskilt när det gäller växtvävnader, som är flerskiktade med celler av olika former, är indexfelet som orsakas av deras struktur och närvaron av ljusabsorberande pigment problematiskt. Till exempel har växtblad en komplex struktur som gör det möjligt för dem att effektivt utnyttja ljuset som kommer in i deras kroppar för fotosyntes1, medan strukturen också orsakar brytningsindexfel, vilket gör dem svåra att observera. Bladen har dock många ljusabsorberande pigment, såsom klorofyll, som avger stark röd fluorescens och brunaktiga pigment produceras genom oxidation2,3. Dessa pigment hindrar också hela berget fluorescensmikroskopi observationer i växter. För att observera växternas inre struktur har därför avfärgning och fixering genom alkohol och röjning med klorhydrat använts under lång tid för att eliminera brytningsindex missmatchning och autofluorescens4,5. Dessa konventionella metoder har antagits i många år, men de har nackdelen att eliminera fluorescensen av fluorescerande proteiner samtidigt6,7. Detta är problematiskt eftersom fluorescerande proteiner har blivit oumbärliga i nuvarande fluorescerande avbildning.
Därför har ClearSee (CS) och ClearSeeAlpha (CSA) utvecklats som optiska clearingreagenser för växtvävnader. Båda reagenserna minskar klorofyll autofluorescens samtidigt som stabiliteten hos fluorescerande proteiner7,8 bibehålls. CSA är särskilt användbart när bruna pigment produceras på grund av vävnadsoxidation. Med hjälp av dessa clearingreagenser är det möjligt att observera cellstrukturen och proteinlokaliseringen inuti växtkroppen utan fysisk sektionering.
Denna metod består av fixering, tvättning och rengöring. Fixering är ett kritiskt steg i det här protokollet. Om det fluorescerande proteinet inte observeras efter PFA-fixering kommer det inte att observeras efter behandling med clearinglösning. Penetrationen av PFA-lösning i vävnader är kritisk, men hög vakuumbehandling rekommenderas inte eftersom det kan förstöra cellstrukturen. Vakuumförhållanden och fixeringsperioder bör optimeras för varje typ av vävnad och art. Det rekommenderas att kontrollera fluorescerande proteiner även efter fixering. Även om proverna vanligtvis var fasta i 30-60 min vid rumstemperatur, kan de fixeras vid 4 °C under en längre tid (över natten eller mer).
Som visas i figur 6A hade vissa natriumdeoxikolater en blekgul färg när de upplöstes. Sådana natriumdeoxikolalatlösningar visade stark autofluorescens i regionen 400-600 nm efter excitation vid 380 nm (figur 6B). Denna autofluorescens förhindrar optisk rensning och fluorescensavbildning. Användare bör kontrollera färgen på natriumdeoxikolatlösning eftersom kvaliteten på reagenset kan skilja sig åt på grund av renhet, lot-to-lot variation eller andra skäl.
De clearinglösningar som används här har höga koncentrationer av natriumdeoxikolat, vilket kan förstöra membranstrukturen. Plasmamembranmarkören (RPS5Apro::tdTomato-LTI6b) observerades även efter CS-behandling7. Det kan dock vara bättre att minska koncentrationen av natriumdeoxikolat, beroende på strukturen och vävnaden av intresse. Bilder med förbättrad klarhet erhölls faktiskt för Arabidopsis pistiller med modifierad CS, där koncentrationen av natriumdeoxykolat minskas med hälften. Minskade koncentrationer av natriumdeoxikolat krävde dock förlängda behandlingstider (t.ex. 1 månad för arabidopsis pistils).
CS kan minska röd autofluorescens (>610 nm) för att avlägsna klorofyll i behandlade prover. 500-600 nm intervall autofluorescens (gul till orange) förblev dock även i CS-behandlade prover7. Denna autofluorescens tros härledas från cellväggen och andra cellulära komponenter, såsom lignin12,13. Därför är det svårt att göra vävnader, såsom stjälkar med utvecklade sekundära väggar, helt transparenta genom CS-behandling.
Flera röjningreagenser förutom de som används här har utvecklats för att observera fluorescerande proteiner i växter med fluorescerande mikroskopi14,15,16,17. Jämfört med dessa metoder tar CS och CSA bort klorofyll och minskar autofluorescens, vilket gör växtvävnaderna mer transparenta. Utvecklade nyligen en förbättrad metod, iTOMEI, för fixering, tvättmedelsrensning och montering för att justera brytningsindexet matchar inte18. I Arabidopsis plantor rensade iTOMEI vävnaden inom 26 h.
CS är tillämpligt på ett brett spektrum av växtarter, såsom Arabidopsis thaliana, Physcomitrium patens7, Chrysanthemum morifolium, Cucumis sativus, Nicotiana benthamiana, Nicotiana tabacum, Torenia fournieri8, Allium ochotense19, Astragalus sinicus20, avokado21, korn22, Brassica rapa23, Callitriche 24, Eucalyptus25, majs26, Marchantia polymorpha27, Monophyllaea glabra28, Orobanche minor29, petunia30, rice31, Solanum lycopersicum32, sojabönor33, jordgubbe34, vete35 och Wolffiella hyalina36. För tjockare vävnader kan CS också göra vibratomsektionerna transparenta37,38. Denna metod tillät studier av cellulär struktur och genuttryck mönster i växter37,38. Dessutom observerades nematodinfektioner20,39, svampinfektioner och symbios19,40,41 också djupt inne i de CS-behandlade vävnaderna. Således är denna metod användbar för hela vävnad imaging från mikro- till makro-skalor och kan hjälpa till att upptäcka nya interaktioner mellan olika celler, vävnader, organ och organismer.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes av Japan Society for the Promotion of Science (Grant-in-Aid for Scientific Research on Innovative Areas (JP16H06464, JP16H06280 till T.H.), Anslag för vetenskaplig forskning (B, JP17H03697 till D.K.), anslag för utmanande förberedande forskning (JP18K19331 till D.K.), Anslag för vetenskaplig forskning om innovativa områden (JP20H05358 för D.K.)) och Japan Science and Technology Agency (PRESTO.M-programmet JPMJPR18K4 till D.K.)). Författarna är tacksamma för Live Imaging Center vid Institute of Transformative Bio-Molecules (WPI-ITbM) vid Nagoya University för att stödja de mikroskopiska studierna och Editage (www.editage.com) för engelskspråkig redigering.
Calcofluor White | Sigma-Aldrich | F3543 | Fluorescent Brightener 28; 100 mg/mL in H2O |
ClearSee | 10% (w/v) xylitol, 15% (w/v) sodium deoxycholate, 25% (w/v) urea | ||
Cover glass (18×18 No.1) | MATSUNAMI | C018181 | |
Cover glass (24×24 No.1) | MATSUNAMI | C024241 | |
Cover glass (25×60 No.1) | MATSUNAMI | C025601 | |
Desiccator | AS One | 1-5801-11 | |
Hoechst 33342 | DOJINDO | 346-07951 | 1 mg/mL in H2O |
Needle | TERUMO | NN-2238S | |
Parafilm | Bemis | PM-996 | |
Paraformaldehyde | Nacalai Tesque | 26126-25 | |
Phosphate buffered saline, pH 7.4 | |||
Silicone rubber sheet | AS One | 6-9085-12 | |
Sodium deoxycholate | Tokyo Chemical Industry | C0316 | Figure 6_1; Lot PSGYK-QB |
Sodium deoxycholate | Kishida Chemical | 260-71412 | Figure 6_2; Lot C05543H |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | D6750 | Figure 6_3; Lot SLBS7362 |
Sodium deoxycholate | Sigma-Aldrich | 30970 | Figure 6_4; Lot BCBW0612 |
Sodium deoxycholate | Nacalai Tesque | 10712-96 | Figure 6_5; Lot M5R3403 |
Sodium deoxycholate | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 194-08311 | Figure 6_6; Lot LKL0648 |
Sodium hydroxide | Nacalai Tesque | 31511-05 | |
Sodium sulphite | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 190-03411 | |
Urea | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 211-01213 | |
Vacuum pump | BUCHI | V-700 | |
Xylitol | FUJIFILM Wako Pure Chemical | 248-00545 |