뇌하수체 줄기 세포 생물학을 탐구하기 위해 시험관 내 모델로 마우스 뇌하수체에서 오가노이드 개발
Summary
뇌하수체는 신체의 내분비 시스템의 핵심 조절자입니다. 이 기사는 생물학과 기능이 제대로 이해되지 않은 땀샘의 줄기 세포 집단을 연구하기 위해 새로운 3D 시험관 내 모델로서 마우스 뇌하수체에서 오가노이드의 발달을 설명합니다.
Abstract
뇌하수체는 신체 성장, 신진 대사, 성적 성숙, 생식 및 스트레스 반응을 포함한 주요 생리 과정을 조절하는 마스터 내분비선입니다. 십여 년 전, 뇌하수체에서 줄기 세포가 확인되었습니다. 그러나, 생체내 트랜스제닉 접근법의 적용에도 불구하고, 이들의 표현형, 생물학 및 역할은 불분명하다. 이러한 수수께끼를 해결하기 위해 뇌하수체 줄기 세포 생물학을 깊이 풀기 위해 새롭고 혁신적인 오가노이드 시험관 내 모델이 개발되었습니다. 오가노이드는 정의된 배양 조건 하에서 조직(상피) 줄기 세포로부터 자가발전하고 그 줄기 세포와 그 조직의 여러 특징을 재검토하는 3D 세포 구조를 나타낸다. 마우스 뇌하수체 유래 오가노이드가 땀샘의 줄기 세포로부터 발달하고 생체 내 표현형 및 기능적 특성을 충실하게 재구성한다는 것이 여기에서 보여집니다. 그 중에서도, 이들은 이식성으로 가해진 국소 손상에 반응하여 발생하는 생체내에서 줄기 세포의 활성화 상태를 재현한다. 오가노이드는 줄기 표현형을 견고하게 유지하면서 장기간 확장 가능합니다. 새로운 연구 모델은 신생아 성숙에서 노화와 관련된 퇴색, 건강에서 병든 땀샘에 이르기까지 뇌하수체 리모델링의 주요 조건 동안 줄기 세포의 표현형과 행동을 해독하는 데 매우 중요합니다. 여기에서, 마우스 뇌하수체 유래 오가노이드를 확립하기 위한 상세한 프로토콜이 제시되며, 이는 뇌하수체 줄기 세포의 수수께끼 같은 세계로 뛰어들 수 있는 강력한 도구를 제공한다.
Introduction
뇌하수체는 시상 하부와 연결된 뇌 기저부에 위치한 작은 내분비선입니다. 땀샘은 말초 및 중추(시상 하부) 입력을 통합하여 조정되고 조정된 호르몬 방출을 생성함으로써 적절한 시간에 적절한 호르몬을 생산하기 위한 하류 표적 내분비 기관(예: 부신 땀샘 및 생식선)을 조절합니다. 뇌하수체는 내분비 시스템의 핵심 조절자이므로 당연히 마스터 글 랜드1이라고 불립니다.
마우스 뇌하수체는 세 개의 엽(도 1), 즉 전엽(AL), 중간엽(IL), 및 후엽(PL)으로 구성된다. 주요 내분비 AL은 성장 호르몬 (GH)을 생산하는 somatotropes를 포함하여 다섯 가지 호르몬 세포 유형을 포함; 프로락틴(PRL)을 생성하는 락토트로프; 부신피질자극호르몬(ACTH)을 분비하는 피질염 호르몬; 갑상선 자극 호르몬 (TSH) 생산을 담당하는 갑상선 로프; 황체 형성 호르몬 (LH)과 여포 자극 호르몬 (FSH)을 만드는 생식선 로프. PL은 호르몬 옥시토신과 바소프레신 (항 이뇨 호르몬)이 저장되는 시상 하부의 축삭 돌기로 구성됩니다. IL은 AL과 PL 사이에 위치하고 있으며 멜라노사이트 자극 호르몬 (MSH)을 생산하는 멜라노로프를 수용합니다. 인간 뇌하수체에서, IL은 발달 중에 퇴행하고, 멜라노트로프는AL1 내에 퍼진다. 내분비 세포 이외에, 뇌하수체는 또한 줄기 세포의 풀을 포함하고, 본질적으로 전사 인자 SOX2 2,3,4,5,6에 의해 표시된다. 이들 SOX2+ 세포는 구순구개열의 상피 내벽(AL과 IL 사이의 배아 잔여 내강)인 한계 구역(MZ)에 위치하거나, AL의 실질에 걸쳐 클러스터로서 확산되어, 샘 내에 2개의 줄기 세포 틈새를 제안한다(도 1)2,3,4,5,6.
뇌하수체의 필수 불가결 한 특성을 감안할 때, 땀샘의 오작동은 심각한 이환과 관련이 있습니다. 과뇌하수체증(하나 이상의 호르몬의 과다 분비를 특징으로 함) 및 뇌하수체 기능 저하증(하나 이상의 호르몬의 결함 또는 누락된 생산)은 뇌하수체 신경내분비 종양(PitNETs; 예를 들어, 쿠싱병으로 이어지는 ACTH 생성 종양) 또는 유전적 결함(예를 들어, 왜소증을 초래하는 GH 결핍)7에 의해 야기될 수 있다. 또한, 뇌하수체 수술 (예를 들어, 종양을 제거하기 위해), 감염 (예를 들어, 시상 하부 – 뇌하수체 결핵, 또는 세균성 수막염 또는 뇌염에 따른 감염), Sheehan 증후군 (출생시 심한 혈액 손실로 인한 불충분 한 혈류로 인한 괴사), 뇌하수체 졸중 및 외상성 뇌 손상은 뇌하수체 기능 저하의 다른 중요한 원인입니다8 . 마우스 뇌하수체는 재생 능력을 가지고 있으며, 내분비 세포 9,10의 트랜스제닉 절제에 의해 도입 된 국소 손상을 복구 할 수 있음이 밝혀졌습니다. SOX2+ 줄기 세포는 활성화된 표현형을 나타내는 가해진 손상에 급격하게 반응하며, 이는 향상된 증식(줄기 세포 확장의 결과)과 줄기 관련 인자 및 경로(예: WNT/NOTCH)의 발현 증가로 특징지어집니다. 더욱이, 줄기 세포는 절제 호르몬을 발현하기 시작하여, 최종적으로 9,10개월 후(5 내지 6)개월에 걸쳐 고갈된 세포 집단의 실질적인 회복을 초래한다. 또한, 땀샘의 신생아 성숙 단계 (출생 후 처음 3 주) 동안, 뇌하수체 줄기 세포는활성화 된 상태에서 번성하는 반면, 유기체 노화는 노화 (또는 ‘화염’)시 염증 (미세) 환경 증가로 인해 계내 줄기 세포 기능 저하와 관련이 있습니다 (또는 ‘화염’)10,14 . 또한, 선에서의 종양발생은 또한 줄기 세포 활성화 7,15와 관련된다. 줄기 세포 활성화가 뇌하수체 리모델링의 여러 상황에서 발견되었지만 (7,16에서 검토), 근본적인 메커니즘은 불분명하다. 생체 내 접근법 (예 : 트랜스제닉 마우스의 계보 추적)은 뇌하수체 줄기 세포의 명확하거나 포괄적 인 그림을 전달하지 못했기 때문에 정상 및 병든 뇌하수체에서 줄기 세포 생물학을 탐구하기위한 신뢰할 수있는 시험관 내 모델의 개발이 필수적입니다. 원발성 뇌하수체 줄기 세포의 표준 시험관내 배양은 표현형의 급속한 손실을 갖는 매우 제한된 성장 능력 및 비생리학적 (2D) 조건 때문에 부적절하게 남아있다(보다 상세한 개요를 위해,16 참조). 3D 구체 배양물(pituispheres)은 측면 집단 및 SOX2+ 표현형 2,3,4에 의해 확인된 바와 같이 뇌하수체 줄기 세포로부터 확립되었다. 뇌하수구는 줄기 세포로부터 clonally 성장하고, 줄기 마커를 발현하고, 내분비 세포 유형으로의 분화 능력을 나타낸다. 그러나, 그것들은 제한된 통과 가능성 (2-3 구절)만을 보여주면서 상당히 확장되지 않습니다 3,4. 구형 구조체는 또한 50% 희석된 마트리겔에서 1주일 동안 배양하였을 때 해리되지 않은 뇌하수체 줄기세포 클러스터로부터 수득되었으나 확장성은 나타나지 않았다(도 17). 뇌하수구 접근법은 주로 줄기 세포 번호에 대한 판독 도구로 사용되지만, 추가 적용은 열등한 확장 용량(16)에 의해 제한된다.
이러한 단점을 해결하고 극복하기 위해, MZ 및 실질 줄기 세포를 함유하는 마우스의 주요 내분비 AL로부터 시작하는 새로운 3D 모델, 즉 오가노이드가 최근에 확립되었다. 오가노이드는 실제로 뇌하수체의 줄기 세포에서 유래하고 그들의 표현형18을 충실하게 재구성하는 것으로 나타났습니다. 또한, 오가노이드는 장기간 확장 가능하며 줄기 성질을 견고하게 유지합니다. 따라서, 그들은 심오한 탐구를 위해 일차 뇌하수체 줄기 세포를 확장하는 신뢰할 수있는 방법을 제공합니다. 이러한 탐색은 뇌하수체로부터 분리될 수 있는 제한된 수의 줄기 세포로는 달성될 수 없으며, 이는 또한 2D 조건(16)에서 팽창가능하지 않다. 오가노이드는 새로운 뇌하수체 줄기 세포 특징 (생체 내에서 번역 가능)을 밝히는 데 유용하고 신뢰할 수있는 도구임을 보여주었습니다 (생체 내에서 번역 가능)14,18. 중요하게도, 오가노이드 모델은 국소 조직 손상 및 신생아 성숙 동안 발생하는 것으로서 뇌하수체 줄기 세포 활성화 상태를 충실하게 반영하여, 향상된 형성 효율을 나타내고 상향조절된 분자 경로를 복제한다(14,18). 따라서 뇌하수체 유래 오가노이드 모델은 혁신적이고 강력한 뇌하수체 줄기 세포 생물학 연구 모델이자 줄기 세포 활성화 판독 도구입니다.
이 프로토콜은 마우스 뇌하수체 유래 오가노이드의 확립을 상세히 기술한다. 이러한 목적을 위해, AL은 단리되고 단일 세포로 해리되며, 이는 세포외 매트릭스-모방 매트릭스(이하 ECM으로 지칭됨)에 매립된다. 세포-ECM 어셈블리는 이어서 줄기 세포 성장 인자 및 뇌하수체 배아 조절제를 본질적으로 함유하는 정의된 배지에서 배양된다 (추가로 ‘뇌하수체 오가노이드 배지'(PitOM)로 지칭됨)18; 표 1). 일단 오가노이드가 완전히 발달되면(10-14일 후), 이들은 순차적 계대통과 골짜기를 더욱 확장시킬 수 있고 광범위한 하류 탐사를 거칠 수 있다(예를 들어, 면역형광, RT-qPCR, 및 벌크 또는 단일 세포 전사체; 그림 1). 장기적으로 뇌하수체 줄기 세포 오가노이드가 조직 복구 접근법과 재생 의학의 길을 열어 줄 것으로 예상됩니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
여기에 기술된 바와 같이 AL 유래 오가노이드는 시험관내에서 뇌하수체 줄기 세포를 연구하는 강력한 연구 모델을 나타낸다. 현재이 오가노이드 접근법은 일차 뇌하수체 줄기 세포를 안정적이고 견고하게 성장하고 확장 할 수있는 유일한 도구입니다. 배아 줄기 세포 (ESC) 또는 유도 만능 줄기 세포 (iPSC)로부터 유래 된 뇌하수체 오가노이드 모델이 이전에 보고되었으며, 이는 뇌하수체 배아…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작업은 KU Leuven Research Fund와 FWO (Fund for Scientific Research) – Flanders의 보조금으로 지원되었습니다. E.L. (11A3320N) 및 C.N. (1S14218N)은 FWO / FWO-SB 박사 학위 펠로우십의 지원을 받습니다.
Materials
| 2-Mercaptoethanol | Sigma-Aldrich | M6250 | |
| 48-well plates, TC treated, individually wrapped | Costar | 734-1607 | |
| A83-01 | Sigma-Aldrich | SML0788 | |
| Advanced DMEM | Gibco | 12491023 | |
| Albumin Bovine (cell culture grade) | Serva | 47330 | |
| B-27 Supplement (50X), minus vitamin A | Gibco | 12587010 | |
| Base moulds | VWR | 720-1918 | |
| Buffer RLT | Qiagen | 79216 | |
| Cassettes, Q Path Microtwin | VWR | 720-2191 | |
| Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | Falcon | 352340 | |
| Cholera Toxin from Vibrio cholerae | Sigma-Aldrich | C8052 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | D5025 | |
| D-glucose | Merck | 108342 | |
| Dimethylsulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D2650 | |
| DMEM, powder, high glucose | Gibco | 52100039 | |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 30120086 | |
| Epredia SuperFrost Plus Adhesion slides | Thermo Fisher Scientific | J1800AMNZ | |
| Epredia HistoStar Embedding Workstation, 220 to 240Vac | Thermo Fisher Scientific | 12587976 | |
| Ethanol Absolute 99.8+% | Thermo Fisher Scientific | 10342652 | |
| Fetal bovine serum (FBS) | Sigma-Aldrich | F7524 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | |
| HEPES | Sigma-Aldrich | H4034 | |
| HEPES Buffer Solution | Gibco | 15630056 | |
| InSolution Y-27632 | Sigma-Aldrich | 688001 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25030081 | |
| Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix, LDEV-Free | Corning | 15505739 | |
| Mr. Frosty Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | |
| N-2 Supplement (100X) | Thermo Fisher Scientific | 17502048 | |
| N-Acetyl-L-cysteine | Sigma-Aldrich | A7250 | |
| Nunc Biobanking and Cell Culture Cryogenic Tubes | Thermo Fisher Scientific | 375353 | |
| Paraformaldehyde for synthesis (PFA) | Merck | 818715 | |
| PBS, pH 7.4 | Gibco | 10010023 | |
| Penicillin G sodium salt | Sigma-Aldrich | P3032 | |
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15140122 | |
| Phenol red | Merck | 107241 | |
| Potassium Chloride (KCl) | Merck | 104936 | |
| Recombinant Human EGF Protein, CF | R&D systems | 236-EG | |
| Recombinant Human FGF basic/FGF2/bFGF (157 aa) Protein | R&D systems | 234-FSE | |
| Recombinant Human FGF-10 | Peprotech | 100-26 | |
| Recombinant Human IGF-1 | Peprotech | 100-11 | |
| Recombinant Human IL-6 | Peprotech | 200-06 | |
| Recombinant Human Noggin | Peprotech | 120-10C | |
| Recombinant Human R-Spondin-1 | Peprotech | 120-38 | |
| Recombinant Human/Murine FGF-8b | Peprotech | 100-25 | |
| Recombinant Mouse Sonic Hedgehog/Shh (C25II) N-Terminus | R&D systems | 464-SH | |
| RNeasy micro kit | Qiagen | 74004 | |
| SB202190 | Sigma-Aldrich | S7067 | |
| SeaKem LE Agarose | Lonza | 50004 | |
| Sodium Chloride (NaCl) | BDH | 102415K | |
| Sodium di-Hydrogen Phosphate 1-hydrate | PanReac-AppliChem | A1047 | |
| Sodium Hydrogen Carbonate (NaHCO3) | Merck | 106329 | |
| Sodium-Pyruvate (C3H3NaO3) | Sigma-Aldrich | P5280 | |
| Stericup-GP, 0.22 µm | Millipore | SCGPU02RE | |
| Steriflip-GP Sterile Centrifuge Tube Top Filter Unit, 0.22 μm | Millipore | SCGP00525 | |
| Sterile water | Fresenius | B230531 | |
| Streptomycin sulfate salt | Sigma-Aldrich | S6501 | |
| Syringe, with BD Microlance needle with intradermal bevel, 26G | BD Plastipak | BDAM303176 | |
| Thermo Scientific Excelsior ES Tissue Processor | Thermo Scientific | 12505356 | |
| Titriplex III | Merck | 108418 | |
| TrypL Express Enzyme (1X), phenol red | Thermo Fisher Scientific | 12605028 | |
| Trypsin inhibitor from Glycine max (soybean) | Sigma-Aldrich | T9003 | |
| Trypsin solution 2.5 % | Thermo Fisher Scientific | 15090046 |
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