שיטת צביעה כפולה לזיהוי פקטין באינטראקציה בין צמחים לפטריות

Summary

פרוטוקול זה מתאר שיטה מיקרוסקופית לזיהוי פקטין באינטראקציה בין פטריית קפה.

Abstract

תאי הצמח משתמשים במנגנונים מבניים שונים, מכוננים או בלתי ניתנים להשראה, כדי להגן על עצמם מפני זיהום פטרייתי. אנקפסולציה היא מנגנון אינדוקטיבי יעיל לבודד את האוסטוריה הפטרייתית מהפרוטופלסט של תאי הצמח. לעומת זאת, פקטין, אחד המרכיבים הפולימריים של דופן התא, הוא מטרה של מספר אנזימים פקטוליטיים באינטראקציות נקרוטרופיות. כאן מוצג פרוטוקול לאיתור פקטין ופטריות באמצעות מיקרוסקופיה אופטית. נחקרים האנקפסולציה העשירה בפקטין בתאי עלי הקפה הנגועים בפטריית החלודה Hemileia vastatrix ובשינוי דופן תא המזופיל המושרה על ידי Cercospora coffeicola . דגימות העלים הנגעים תוקנו בתמיסת קרנובסקי, התייבשו והוטמעו בגליקון מתקרילט למשך 2-4 ימים. כל השלבים בוצעו על ידי שאיבת ואקום כדי להסיר אוויר בחללים הבין-תאיים ולשפר את תהליך ההטבעה. הבלוקים המשובצים חולקו למקטעים בעובי 5-7 מיקרומטר, שהופקדו על מגלשת זכוכית מכוסה במים ולאחר מכן חוממו בטמפרטורה של 40 מעלות צלזיוס למשך 30 דקות. לאחר מכן, המגלשות הוכתמו פעמיים עם 5% כותנה כחולה בלקטופנול כדי לזהות את הפטרייה ו-0.05% רותניום אדום במים כדי לזהות פקטין (קבוצות חומציות של חומצות פוליאוריות של פקטין). האוסטוריה פטרייתית של Hemileia vastatrix נמצאה עטופה בפקטין. בקפה סרקוספוריוזיס, תאי מזופיל הפגינו התמוססות של דפנות התא, ונצפו הרפיות וקונידיופורים בין-תאיים. השיטה המוצגת כאן יעילה לזיהוי תגובה הקשורה לפקטין באינטראקציה בין צמחים לפטריות.

Introduction

מנגנוני ההגנה על דופן התא בצמחים חיוניים לריסון זיהום פטרייתי. מחקרים דיווחו על שינויים בעובי ובהרכב דופן התא מאז המאה^{ה-19, 1,2}. שינויים אלה יכולים להיות מושרים על ידי פתוגן פטרייתי המעורר את היווצרותה של פפילה, אשר מונעת מפטריות להיכנס לתא או יכול לשמש כדי לתמצת את hyphae כדי לבודד את התא המארח protoplast מן haustoria פטרייתי. ייצור מחסום דופן תא דינמי (כלומר, פפילה והאוסטוריום עטוף במלואו) חשוב כדי לקדם את עמידות הצמח³. מחקרים היסטופתולוגיים על מחלות הקשורות לפטריות חקרו את התרחשותם של מנגנונים אלה ותיארו את הפולימרים של דופן התא, תאית, המיצלולוז (ארבינוקסילנים) ויבלות כמנגנוני התנגדות להתקפה פטרייתית 4,5,6,7.

דופן התא היא המחסום הראשון מפני התקפה מיקרואורגניזמית, הפוגעת באינטראקציה בין צמחים לפטריות. פוליסכרידים פקטיים מרכיבים את דופן התא ומהווים כ-30% מהרכב דופן התא בתאים ראשוניים של צמחי אאודיקוט שבהם הומוגלקטורונאנים הם הפולימר הנפוץ ביותר (בערך 60%)⁸. הגולגי מפריש תרכובות פקטין מורכבות המרכיבות את שרשראות החומצה הגלקטורונית, אשר עשויות או לא יכולות להיות מתילציה ^8,9. מאז 2012, הספרות הצביעה על כך שמידת הפקטין מתיל אסטריפיקציה היא קריטית לקביעת התאימות במהלך ההדבקה על ידי אנזימים פקטיים מיקרוביאליים 10,11,12. לפיכך, פרוטוקולים נדרשים כדי לאמת את נוכחותם והפצתם של תרכובות פקטיות במערכות פאתוסיסטמיות פטרייתיות צמחיות.

טכניקות שונות שימשו כדי לזהות את האנקפסולציה של papillae או haustoria. שיטות הייחוס בהן נעשה שימוש הן מיקרוסקופיית אלקטרונים (TEM) של רקמות קבועות ומיקרוסקופיה קלה של רקמות חיות וקבועות. בנוגע ל-TEM, מספר מחקרים הדגימו את התפקיד המבני של ניצני דופן התא בהתנגדות פטרייתית 13,14,15,16, וכי השימוש בלקטינים ונוגדנים הוא שיטה מורכבת לאיתור פולימרים של פחמימות 16. עם זאת, מחקרים מראים כי מיקרוסקופיית אור היא גישה חשובה וכי הכלים ההיסטוכימיים והאימונוהיסטוכימיים מאפשרים הבנה טובה יותר של הרכב מעטפת הפפילה וההאוזטוריום ^6,7.

פטריות פתוגניות מראות שני סוגים עיקריים של אורחות חיים: ביוטרופיים ונקרוטרופיים. פטריות ביוטרופיות תלויות בתאים חיים לצורך תזונתן ואילו פטריות נקרוטרופיות הורגות את התאים המארחים, ואז חיות ברקמות המתות¹⁷. באמריקה הלטינית, חלודה של עלי קפה, הנגרמת על ידי הפטרייה Hemileia vastatrix, היא מחלה חשובה בגידולי קפה^18,19. Hemileia vastatrix מציגה התנהגות ביוטרופית, ובין השינויים המבניים שנצפו במיני קפה עמידים או בתרבויות, דווח על תגובת רגישות יתר, תצהיר של קאלוז, תאית וליגנין על דפנות התא, כמו גם היפרטרופיה של תאים¹⁴. למיטב ידיעת המחברים, הספרות אינה מדווחת על מידע על חשיבותו של פקטין בעמידות לחלודה בקפה. מצד שני, פטריות נקרוטרופיות הגורמות לצרקוספוריוזיס מכוונות לפקטין באמצעות קבוצה של אנזימים הקשורים לפירוק דופן התא, כגון פקטינזות ופוליגלקטורונאז²⁰. סרקוספוריוזיס בקפה, הנגרמת על ידי הפטרייה Cercospora coffeicola הוא גם איום גדול על גידולי קפה^21,22. פטרייה זו גורמת לנגעים נמקיים הן בעלים והן בפירות יער. לאחר החדירה, C. coffeicola מיישב רקמות צמחים דרך מסלולים תוך תאיים ובין תאיים 23,24,25.

הפרוטוקול הנוכחי חוקר את הימצאותם של מבנים פטרייתיים ופקטין על דפנות התא. פרוטוקול זה שימושי כדי לזהות את התגובה הצמחית הקשורה לפקטין (מוכתם בצבע אדום רותניום, שהוא ספציפי לקבוצות חומציות של חומצות פוליאוריוניות של פקטין), המושרה על ידי המארח באינטראקציה ביוטרופית עם פטרייה. זה גם עוזר לאמת את ההשפעה של פטריות necrotrophic על התדרדרות של דפנות התאים pectic. התוצאות הנוכחיות מצביעות על כך ששיטת ההכתמה הכפולה יעילה להבחנה בין מבנים ולשלב הרבייה של פטריות.

Protocol

1. הכנת תמיסת האגירה והריאגנטים הכן 2 M cacodylate buffer על ידי הוספת 4.28 גרם של נתרן cacodylate ל 100 מ”ל של מים מזוקקים ולהתאים את ה- pH ל 7.25 עם 0.2 N HCl. הכן 100 מ”ל של תמיסת התיקון של קרנובסקי על ידי ערבוב של 10 מ”ל של 25% גלוטארלדהיד מימי, 10 מ”ל של 10% פורמלדהיד מימי, 25 מ”ל של 2 M cacodylate buffer, ו 0.5 מ”ל של 0.5…

Representative Results

צביעת הלקטופנול הכחולה מכותנה על החלק המשובץ ב-GMA חשפה את נוכחותם של מספר מבנים פטרייתיים בין תאי מזופיל קפה ובתוךיהם באינטראקציות פטרייתיות ביוטרופיות ונקרוטרופיות. במערכת הפתוסית הביוטרופית, כאשר היא מוכתמת בשיטת ההכתמה הכפולה, Hemileia vastatrix hyphae המכילה את דפנות התא וא?…

Discussion

העבודה הנוכחית מציגה בדיקה היסטוכימית חלופית עם כתמים כפולים כדי לחקור את הרכב הפקטין של דפנות התאים, המתמצת את האוסטוריה במערכת פאתוסיסטית ביוטרופית. המטרה היא גם להדגים את היעילות של השיטה לאיתור פטרייה נקרוטרופית ושינויים בדופן התא המושרים על ידה. כאן, פקטין של דפנות תא פרנכימה קפה יכ?…

Materials

Blades DB80 HS	Leica	14035838383	Sectioning
Cacodylate buffer	EMS	# 11652	Fixation
Cotton Blue Lactophenol	Metaquímica	70SOLSIG024629	Staining
Formaldehyde	EMS	#15712	Fixation
Glutaraldehyde	EMS	#16216	Fixation
Historesin Kit	Technovit /EMS	#14653	Historesin for embedding
Hot plate	Dubesser	SSCD25X30-110V	Staining
Microscopy	Zeiss	#490040-0030-000	Image capture
Microtome (Leica RM 2540)	Leica	149BIO000C1 14050238005	Sectioning
Plastic molding cup tray	EMS	10176-30	Staining
Ruthenium red	LABHouse	#006004	Staining
Software Axion Vision	Zeiss	#410130-0909-000	Image capture
Vaccum pump	Prismatec	131 TIPO 2 V.C.	Fixation