Método de doble tinción para detectar la pectina en la interacción planta-hongo

Summary

Este protocolo describe un método microscópico para detectar la pectina en la interacción café-hongo.

Abstract

Las células vegetales utilizan diferentes mecanismos estructurales, ya sean constitutivos o inducibles, para defenderse de la infección por hongos. La encapsulación es un mecanismo inducible eficiente para aislar los haustorios fúngicos del protoplasto de células vegetales. Por el contrario, la pectina, uno de los componentes poliméricos de la pared celular, es un objetivo de varias enzimas pectolíticas en interacciones necrotróficas. Aquí, se presenta un protocolo para detectar pectina e hifas fúngicas a través de microscopía óptica. Se investiga la encapsulación rica en pectina en las células de las hojas de café infectadas por el hongo de la roya Hemileia vastatrix y la modificación de la pared celular mesófila inducida por Cercospora coffeicola . Las muestras de hojas lesionadas se fijaron con la solución de Karnovsky, se deshidrataron y se incrustaron en metacrilato de glicol durante 2-4 días. Todos los pasos fueron seguidos por el bombeo de vacío para eliminar el aire en los espacios intercelulares y mejorar el proceso de incrustación. Los bloques incrustados se seccionaron en secciones de 5-7 μm de espesor, que se depositaron en un portaobjetos de vidrio cubierto con agua y posteriormente se calentaron a 40 ° C durante 30 min. A continuación, los portaobjetos se tiñeron dos veces con 5% de azul algodón en lactofenol para detectar el hongo y 0,05% de rojo rutenio en agua para detectar pectina (grupos ácidos de ácidos poliurónicos de pectina). Se encontró que los haustorios fúngicos de Hemileia vastatrix estaban encapsulados por pectina. En la cercosporiosis del café, las células mesófilas exhibieron disolución de las paredes celulares, y se observaron hifas y conidióforos intercelulares. El método presentado aquí es efectivo para detectar una respuesta asociada a la pectina en la interacción planta-hongo.

Introduction

Los mecanismos de defensa de la pared celular en las plantas son cruciales para contener la infección por hongos. Los estudios han reportado cambios en el grosor y la composición de la pared celular desde el^{siglo 19 1,2}. Estos cambios pueden ser inducidos por un patógeno fúngico que estimula la formación de una papila, que impide que los hongos entren en la célula o podría usarse para encapsular las hifas para aislar el protoplasto de la célula huésped de la haustoria fúngica. La producción de una barrera dinámica de la pared celular (es decir, papilas y un haustorio completamente encerrado) es importante para promover la resistencia de la planta³. Los estudios histopatológicos sobre enfermedades relacionadas con hongos han investigado la aparición de estos mecanismos y han descrito los polímeros de la pared celular, la celulosa, la hemicelulosa (arabinoxilanos) y la callosa como mecanismos de resistencia al ataque fúngico 4,5,6,7.

La pared celular es la primera barrera contra el ataque de microorganismos, perjudicando la interacción planta-hongo. Los polisacáridos pécticos componen la pared celular y representan aproximadamente el 30% de la composición de la pared celular en las células primarias de las plantas eudicot en las que los homogalacturonanos son el polímero más abundante (aproximadamente el 60%)⁸. El Golgi secreta compuestos complejos de pectina que componen las cadenas de ácido galacturónico, que pueden o no estar metilados ^8,9. Desde 2012, la literatura ha señalado que el grado de esterificación metilo de pectina es crítico para determinar la compatibilidad durante la infección por enzimas pécticas microbianas 10,11,12. Por lo tanto, se requieren protocolos para verificar la presencia y distribución de compuestos pécticos en los patosistemas planta-fúngico.

Se han utilizado diversas técnicas para detectar la encapsulación de papilas o haustorias. Los métodos de referencia utilizados son la microscopía electrónica de transmisión (TEM) de tejido fijo y la microscopía de luz de tejidos vivos y fijos. En cuanto a tem, varios estudios han demostrado el papel estructural de las aposiciones de la pared celular en la resistencia fúngica ^13,14,15,16, y que el uso de lectinas y anticuerpos es un método intrincado para localizar polímeros de carbohidratos¹⁶. Sin embargo, los estudios muestran que la microscopía de luz es un enfoque importante y que las herramientas histoquímicas e inmunohistoquímicas permiten una mejor comprensión de la composición de las papilas y el revestimiento de haustorio ^6,7.

Los hongos patógenos muestran dos tipos principales de estilos de vida: biotróficos y necrotróficos. Los hongos biotróficos dependen de las células vivas para su nutrición, mientras que los hongos necrotróficos matan a las células huésped y luego viven en los tejidos muertos¹⁷. En América Latina, la roya de la hoja del café, causada por el hongo Hemileia vastatrix, es una enfermedad importante en los cultivos de café^18,19. Hemileia vastatrix presenta un comportamiento biotrófico y, entre los cambios estructurales observados en especies o cultivares de café resistentes, se ha reportado una respuesta de hipersensibilidad, deposición de callosa, celulosa y lignina en las paredes celulares, así como hipertrofia celular¹⁴. Según el conocimiento de los autores, la literatura no informa sobre la importancia de la pectina en la resistencia a la roya del café. Por otro lado, los hongos necrotróficos que causan cercosporiosis se dirigen a la pectina a través de un conjunto de enzimas asociadas con la degradación de la pared celular, como las pectinasas y la poligalacturonasa²⁰. La cercosporiosis en el café, causada por el hongo Cercospora coffeicola, también es una amenaza importante para los cultivos de café^21,22. Este hongo causa lesiones necróticas tanto en las hojas como en las bayas. Después de la penetración, C. coffeicola coloniza los tejidos vegetales a través de las vías intracelulares e intercelulares ^23,24,25.

El presente protocolo investiga la presencia de estructuras fúngicas y pectina en las paredes celulares. Este protocolo es útil para identificar la respuesta de la planta asociada con la pectina (teñida con colorante rojo rutenio, que es específico de los grupos ácidos ácidos poliurónicos de la pectina), inducida por el huésped en una interacción biotrófica con el hongo. También ayuda a verificar el efecto de los hongos necrotróficos en la degradación de las paredes celulares pécticas. Los presentes resultados indican que el método de doble tinción es eficaz para discriminar estructuras y la fase reproductiva de los hongos.

Protocol

1. Preparación de la solución tampón y los reactivos Prepare un tampón de cacodilato de 2 M agregando 4.28 g de cacodilato de sodio a 100 ml de agua destilada y ajuste el pH a 7.25 con 0.2 N HCl. Preparar 100 mL de la solución fijadora karnovsky mezclando 10 mL de glutaraldehído acuoso al 25%, 10 mL de formaldehído acuoso al 10%, 25 mL de tampón de cacodilato al 25% y 0,5 mL de CaCl2 26 M. Enrasar el volumen hasta 100 mL con agua destilada.<b…

Representative Results

La tinción de lactofenol azul algodón en la sección incrustada en GMA reveló la presencia de varias estructuras fúngicas entre y dentro de las células mesófilas del café en las interacciones fúngicas biotróficas y necrotróficas. En el patosistema biotrófico, cuando se tiñe utilizando el método de doble tinción, las hifas de Hemileia vastatrix que contienen paredes celulares y el contenido denso de protoplastos aparecen en azul oscuro tanto en el parénquima esponjoso co…

Discussion

El presente trabajo introduce una prueba histoquímica alternativa de doble tinción para investigar la composición de pectina de las paredes celulares que encapsula la haustoria en un patológico biotrófico. El objetivo también es demostrar la eficacia del método para detectar hongos necrotróficos y cambios en la pared celular inducidos por él. Aquí, la pectina de las paredes celulares del parénquima del café puede encapsular tanto el cuello como el haustorio del hongo de la roya Hemileia vastatrix. Si…

Materials

Blades DB80 HS	Leica	14035838383	Sectioning
Cacodylate buffer	EMS	# 11652	Fixation
Cotton Blue Lactophenol	Metaquímica	70SOLSIG024629	Staining
Formaldehyde	EMS	#15712	Fixation
Glutaraldehyde	EMS	#16216	Fixation
Historesin Kit	Technovit /EMS	#14653	Historesin for embedding
Hot plate	Dubesser	SSCD25X30-110V	Staining
Microscopy	Zeiss	#490040-0030-000	Image capture
Microtome (Leica RM 2540)	Leica	149BIO000C1 14050238005	Sectioning
Plastic molding cup tray	EMS	10176-30	Staining
Ruthenium red	LABHouse	#006004	Staining
Software Axion Vision	Zeiss	#410130-0909-000	Image capture
Vaccum pump	Prismatec	131 TIPO 2 V.C.	Fixation