Dubbelfärgningsmetod för att detektera pektin i interaktion mellan växter och svampar

Summary

Detta protokoll beskriver en mikroskopisk metod för att detektera pektin i kaffe-svampinteraktion.

Abstract

Växtceller använder olika strukturella mekanismer, antingen konstitutiva eller inducerbara, för att försvara sig mot svampinfektion. Inkapsling är en effektiv inducerbar mekanism för att isolera svamp haustoria från växtcellens protoplast. Omvänt är pektin, en av de polymera komponenterna i cellväggen, ett mål för flera pektolytiska enzymer i nekrotrofa interaktioner. Här presenteras ett protokoll för att detektera pektin och svamphyfer genom optisk mikroskopi. Den pektinrika inkapslingen i cellerna i kaffeblad infekterade av rostsvampen Hemileia vastatrix och mesofyllcellväggsmodifieringen inducerad av Cercospora coffeicola undersöks. Lesionerade bladprover fixerades med Karnovsky-lösningen, uttorkades och inbäddades i glykolmetakrylat i 2-4 dagar. Alla steg följdes av vakuumpumpning för att avlägsna luft i de intercellulära utrymmena och förbättra inbäddningsprocessen. De inbäddade blocken sektionerades i 5-7 μm tjocka sektioner, som deponerades på en glasrutschbana täckt med vatten och därefter upphettades till 40 ° C i 30 minuter. Därefter dubbelfärgades bilderna med 5% bomullsblå i laktofenol för att detektera svampen och 0,05% ruteniumrött i vatten för att detektera pektin (sura grupper av polyuroniska syror av pektin). Svamp haustoria av Hemileia vastatrix befanns vara inkapslad av pektin. Vid kaffecercosporios uppvisade mesofyllceller upplösning av cellväggar och intercellulära hyfer och konidioforer observerades. Metoden som presenteras här är effektiv för att detektera ett pektinassocierat svar i interaktionen mellan växter och svampar.

Introduction

Cellväggsförsvarsmekanismer i växter är avgörande för att begränsa svampinfektion. Studier har rapporterat förändringar i cellväggens tjocklek och sammansättning sedan 1800-talet ^1,2. Dessa förändringar kan induceras av en svamppatogen som stimulerar bildandet av en papilla, vilket förhindrar att svampar kommer in i cellen eller kan användas för att kapsla in hyferna för att isolera värdcellens protoplast från svamp haustoria. Produktionen av en dynamisk cellväggsbarriär (dvs. papiller och ett helt inneslutet haustorium) är viktigt för att främja växtresistens³. Histopatologiska studier på svamprelaterade sjukdomar har undersökt förekomsten av dessa mekanismer och har beskrivit cellväggspolymererna, cellulosa, hemicellulosa (arabinoxylaner) och callos som resistensmekanismer mot svampangrepp 4,5,6,7.

Cellväggen är den första barriären mot mikroorganismangrepp, vilket försämrar interaktionen mellan växt och svamp. Pektiska polysackarider komponerar cellväggen och står för cirka 30% av cellväggskompositionen i primära celler av eudikotväxter där homogalakturonaner är den vanligaste polymeren (ungefär 60%)⁸. Golgi utsöndrar komplexa pektinföreningar som utgör galakturonsyrakedjorna, som kan eller inte kan metyleras ^8,9. Sedan 2012 har litteraturen påpekat att graden av pektinmetylförestring är avgörande för att bestämma kompatibiliteten under infektion med mikrobiella pektiska enzymer 10,11,12. Således krävs protokoll för att verifiera närvaron och fördelningen av pektiska föreningar i växtsvamppatosystem.

Olika tekniker har använts för att detektera inkapsling av papiller eller haustoria. Referensmetoderna som används är transmissionselektronmikroskopi (TEM) av fast vävnad och ljusmikroskopi av levande och fasta vävnader. När det gäller TEM har flera studier visat den strukturella rollen av cellväggsappositioner i svampresistens 13,14,15,16, och att användningen av lektiner och antikroppar är en invecklad metod för att lokalisera kolhydratpolymerer ¹⁶. Studier visar dock att ljusmikroskopi är ett viktigt tillvägagångssätt och att de histokemiska och immunohistokemiska verktygen möjliggör en bättre förståelse av sammansättningen av papiller och haustoriumhölje ^6,7.

Patogena svampar visar två huvudtyper av livsstilar: biotrofisk och nekrotrofisk. Biotrofa svampar är beroende av levande celler för sin näring medan nekrotrofa svampar dödar värdcellerna och lever sedan i de döda vävnaderna¹⁷. I Latinamerika är kaffebladrost, orsakad av svampen Hemileia vastatrix, en viktig sjukdom i kaffegrödor^18,19. Hemileia vastatrix uppvisar ett biotrofiskt beteende och bland de strukturella förändringar som observerats hos resistenta kaffearter eller sorter har ett överkänslighetssvar, avsättning av callos, cellulosa och lignin på cellväggarna samt cellhypertrofi¹⁴ rapporterats. Såvitt författarna vet rapporterar litteraturen inte information om pektins betydelse för kafferostmotstånd. Å andra sidan riktar sig nekrotrofa svampar som orsakar cercosporios pektin via en uppsättning enzymer associerade med cellväggsnedbrytning, såsom pektinaser och polygalakturonas²⁰. Cercosporiosis i kaffe, orsakad av svampen Cercospora coffeicola är också ett stort hot mot kaffegrödor^21,22. Denna svamp orsakar nekrotiska lesioner i både löv och bär. Efter penetration koloniserar C. coffeicola växtvävnader genom intracellulära och intercellulära vägar 23,24,25.

Det nuvarande protokollet undersöker förekomsten av svampstrukturer och pektin på cellväggar. Detta protokoll är användbart för att identifiera växtresponsen associerad med pektin (färgad med ruteniumrött färgämne, vilket är specifikt för sura grupper av polyuroniska syror av pektin), inducerat av värden i en biotrofisk interaktion med svamp. Det hjälper också till att verifiera effekten av nekrotrofa svampar på nedbrytningen av pektiska cellväggar. De nuvarande resultaten indikerar att dubbelfärgningsmetoden är effektiv för att diskriminera strukturer och reproduktionsfasen hos svampar.

Protocol

1. Beredning av buffertlösningen och reagenserna Förbered 2 M kacodylatbuffert genom att tillsätta 4,28 g natriumkacodylat till 100 ml destillerat vatten och justera pH till 7,25 med 0,2 N HCl. Förbered 100 ml av Karnovsky fixativ lösning genom att blanda 10 ml 25% vattenhaltig glutaraldehyd, 10 ml 10% vattenhaltig formaldehyd, 25 ml 2 M kacodylatbuffert och 0,5 ml 0,5 M CaCl226. Gör upp volymen till 100 ml med destillerat vatten.OBS: Lösn…

Representative Results

Den bomullsblå laktofenolfärgningen på den GMA-inbäddade sektionen avslöjade närvaron av flera svampstrukturer mellan och inuti kaffemesofyllceller i både biotrofa och nekrotrofa svampinteraktioner. I det biotrofa patosystemet, när det färgas med dubbelfärgningsmetoden, uppträder Hemileia vastatrix hyfer innehållande cellväggar och det täta protoplastinnehållet i mörkblått i både svampigt och palisadparenkym (figur 4A,B)…

Discussion

Föreliggande arbete introducerar ett alternativt dubbelfärgnings histokemiskt test för att undersöka pektinsammansättningen av cellväggar som kapslar in haustoria i ett biotrofiskt patosystem. Syftet är också att demonstrera metodens effektivitet för att detektera nekrotrofisk svamp och cellväggsförändringar inducerade av den. Här kan pektin av kaffeparenkymcellväggar kapsla in både halsen och haustoriumet hos rostsvampen Hemileia vastatrix. Silva et al. har också beskrivit inkapsling av cellulos…

Materials

Blades DB80 HS	Leica	14035838383	Sectioning
Cacodylate buffer	EMS	# 11652	Fixation
Cotton Blue Lactophenol	Metaquímica	70SOLSIG024629	Staining
Formaldehyde	EMS	#15712	Fixation
Glutaraldehyde	EMS	#16216	Fixation
Historesin Kit	Technovit /EMS	#14653	Historesin for embedding
Hot plate	Dubesser	SSCD25X30-110V	Staining
Microscopy	Zeiss	#490040-0030-000	Image capture
Microtome (Leica RM 2540)	Leica	149BIO000C1 14050238005	Sectioning
Plastic molding cup tray	EMS	10176-30	Staining
Ruthenium red	LABHouse	#006004	Staining
Software Axion Vision	Zeiss	#410130-0909-000	Image capture
Vaccum pump	Prismatec	131 TIPO 2 V.C.	Fixation