JoVE Journal > Biology
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
Please note that all translations are automatically generated. Click here for the English version.
생물학

Bitki-Mantar Etkileşiminde Pektini Tespit Etmek için Çift Boyama Yöntemi

Published: February 04, 2022
doi:
10.3791/63432
,
1Faculty of Animal Science and Food Engineering, Department of Basic Sciences,University of São Paulo, 2Laboratory of Nuclear Instrumentation, Center of Nuclear Energy in Agriculture,University of São Paulo

Summary

Bu protokol, kahve-mantar etkileşiminde pektini tespit etmek için mikroskobik bir yöntemi açıklar.

Abstract

Bitki hücreleri, kendilerini mantar enfeksiyonundan korumak için kurucu veya indüklenebilir farklı yapısal mekanizmalar kullanırlar. Enkapsülasyon, mantar haustoriasını bitki hücresi protoplastından izole etmek için etkili bir indüklenebilir mekanizmadır. Tersine, hücre duvarının polimerik bileşenlerinden biri olan pektin, nekrotrofik etkileşimlerde birkaç pektolitik enzimin hedefidir. Burada, optik mikroskopi yoluyla pektin ve mantar hiflerini tespit etmek için bir protokol sunulmaktadır. Pas mantarı Hemileia vastatrix ile enfekte olmuş kahve yapraklarının hücrelerinde pektin bakımından zengin kapsüllenme ve Cercospora coffeicola tarafından indüklenen mezofil hücre duvarı modifikasyonu araştırılmıştır. Lezyonlu yaprak örnekleri Karnovsky çözeltisi ile sabitlendi, dehidre edildi ve 2-4 gün boyunca glikol metakrilat içine gömüldü. Tüm adımları, hücreler arası boşluklardaki havayı uzaklaştırmak ve gömme işlemini iyileştirmek için vakum pompalama izledi. Gömülü bloklar, suyla kaplı bir cam slayt üzerinde biriktirilen ve daha sonra 30 dakika boyunca 40 ° C’de ısıtılan 5-7 μm kalınlığında bölümlere ayrıldı. Daha sonra, slaytlar mantarı tespit etmek için laktofenolde% 5 pamuk mavisi ve pektini (pektinin poliüronik asitlerinin asidik grupları) tespit etmek için suda% 0.05 rutenyum kırmızısı ile çift boyandı. Hemileia vastatrix’in fungal haustoria’sının pektin tarafından kapsüllendiği bulundu. Kahve cercosporiosis’te mezofil hücrelerinde hücre duvarlarında çözünme görüldü ve hücreler arası hifa ve konidioforlar gözlendi. Burada sunulan yöntem, bitki-mantar etkileşiminde pektin ile ilişkili bir yanıtı tespit etmek için etkilidir.

Introduction

Bitkilerde hücre duvarı savunma mekanizmaları mantar enfeksiyonunu engellemek için çok önemlidir. Çalışmalar, 19.yüzyıldan bu yana hücre duvar kalınlığı ve bileşimindeki değişiklikleri bildirmiştir 1,2. Bu değişiklikler, mantarların hücreye girmesini önleyen bir papilla oluşumunu uyaran bir mantar patojeni tarafından indüklenebilir veya konakçı hücre protoplastını mantar haustoriasından izole etmek için hifleri kapsüllemek için kullanılabilir. Dinamik bir hücre duvarı bariyerinin (yani, papillalar ve tamamen kaplanmış bir haustorium) üretimi, bitki direncini arttırmak için önemlidir3. Mantarla ilişkili hastalıklar üzerine yapılan histopatolojik çalışmalar bu mekanizmaların oluşumunu araştırmış ve hücre duvarı polimerleri, selüloz, hemiselüloz (arabinoksilans) ve kalozu mantar atağına direnç mekanizmaları olarak tanımlamıştır 4,5,6,7.

Hücre duvarı, mikroorganizma saldırısına karşı ilk bariyerdir ve bitki-mantar etkileşimini bozar. Pektik polisakkaritler hücre duvarını oluşturur ve homogalakturonanların en bol polimer (kabaca% 60) olduğu ödikot bitkilerinin birincil hücrelerinde hücre duvarı bileşiminin yaklaşık% 30’unu oluşturur8. Golgi, metillenmiş veya metillenemeyen galakturonik asit zincirlerini oluşturan kompleks pektin bileşiklerini salgılar 8,9. 2012 yılından bu yana, literatür, pektin metil esterifikasyon derecesinin, mikrobiyal pektik enzimler10,11,12 tarafından enfeksiyon sırasında uyumluluğu belirlemek için kritik öneme sahip olduğuna dikkat çekmiştir. Bu nedenle, bitki-mantar patosistemlerinde pektik bileşiklerin varlığını ve dağılımını doğrulamak için protokoller gereklidir.

Papilla veya haustoria’nın kapsüllenmesini tespit etmek için çeşitli teknikler kullanılmıştır. Kullanılan referans yöntemleri sabit dokunun transmisyon elektron mikroskobu (TEM) ve canlı ve sabit dokuların ışık mikroskobudur. TEM ile ilgili olarak, çeşitli çalışmalar mantar direncinde hücre duvarı appozisyonlarının yapısal rolünü göstermiştir 13,14,15,16 ve lektinlerin ve antikorların kullanımının karbonhidrat polimerlerini bulmak için karmaşık bir yöntem olduğunu göstermiştir 16. Bununla birlikte, çalışmalar ışık mikroskobunun önemli bir yaklaşım olduğunu ve histokimyasal ve immünohistokimyasal araçların papilla ve haustorium encasement 6,7’nin bileşiminin daha iyi anlaşılmasını sağladığını göstermektedir.

Patojenik mantarlar iki ana yaşam tarzı türü gösterir: biyotrofik ve nekrotrofik. Biyotrofik mantarlar beslenmeleri için canlı hücrelere bağımlıyken, nekrotrofik mantarlar konakçı hücreleri öldürür ve daha sonra ölü dokularda yaşar17. Latin Amerika’da, Hemileia vastatrix mantarının neden olduğu kahve yaprağı pası, kahve bitkilerinde önemli bir hastalıktır18,19. Hemileia vastatrix biyotrofik bir davranış sergiler ve dirençli kahve türlerinde veya çeşitlerinde gözlenen yapısal değişiklikler arasında aşırı duyarlılık yanıtı, hücre duvarlarında kalloz, selüloz ve lignin birikimi ve hücre hipertrofisi14 bildirilmiştir. Yazarların bilgisine göre, literatür pektinin kahve pas direncindeki önemi hakkında bilgi vermemektedir. Öte yandan, cercosporiosise neden olan nekrotrofik mantarlar, pektinazlar ve poligalakturonaz20 gibi hücre duvarı bozulması ile ilişkili bir dizi enzim yoluyla pektin’i hedef alır. Cercospora coffeicola mantarının neden olduğu kahvedeki cercosporiosis de kahve bitkileri için büyük bir tehdittir21,22. Bu mantar hem yapraklarda hem de meyvelerde nekrotik lezyonlara neden olur. Penetrasyondan sonra, C. coffeicola bitki dokularını hücre içi ve hücreler arası yollar23,24,25 yoluyla kolonize eder.

Mevcut protokol, hücre duvarlarında mantar yapılarının ve pektinin varlığını araştırmaktadır. Bu protokol, konakçı tarafından mantar ile biyotrofik bir etkileşimde indüklenen pektin (pektinin poliüronik asitlerinin asidik gruplarına özgü rutenyum kırmızı boya ile boyanmış) ile ilişkili bitki tepkisini tanımlamak için yararlıdır. Ayrıca nekrotrofik mantarların pektik hücre duvarlarının bozulması üzerindeki etkisini doğrulamaya yardımcı olur. Mevcut sonuçlar, çift boyama yönteminin yapıları ve mantarların üreme evresini ayırt etmede etkili olduğunu göstermektedir.

Protocol

1. Tamponlama çözeltisinin ve reaktiflerin hazırlanması 100 mL damıtılmış suya 4.28 g sodyum kakodilat ekleyerek 2 M kakodilat tamponu hazırlayın ve pH’ı 0.2 N HCl ile 7.25’e ayarlayın. 10 mL% 25 sulu glutaraldehit, 10 mL% 10 sulu formaldehit, 25 mL 2 M kakodilat tamponu ve 0.5 mL 0.5 M CaCl 226’yı karıştırarak 100 mL Karnovsky fiksatif çözeltisi hazırlayın. Damıtılmış su ile hacmi 100 mL’ye kadar yapın.NOT: Çözelti buz…

Representative Results

GMA gömülü bölümdeki pamuk mavisi laktofenol boyaması, hem biyotrofik hem de nekrotrofik mantar etkileşimlerinde kahve mezofil hücreleri arasında ve içinde çeşitli mantar yapılarının varlığını ortaya koymuştur. Biyotrofik patosistemde, çift boyama yöntemi kullanılarak boyandığında, hücre duvarları içeren Hemileia vastatrix hifleri ve yoğun protoplast içeriği hem süngerimsi hem de palisade parankimde koyu mavi renkte görünür (Şe…

Discussion

Bu çalışma, biyotrofik bir patosistemde haustoriayı kapsülleyen hücre duvarlarının pektin bileşimini araştırmak için alternatif bir çift boyama histokimyasal testi sunmaktadır. Amaç ayrıca, nekrotrofik mantarı ve bunun neden olduğu hücre duvarı değişikliklerini tespit etmek için yöntemin etkinliğini göstermektir. Burada, kahve parankimi hücre duvarlarının pektini, pas mantarı Hemileia vastatrix’in hem boynunu hem de haustoriumunu kapsayabilir. Silva ve ark. ayrıca kahve-H. vast…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Yazarlar, bu çalışmanın geliştirilmesine verdiği destek için Dr. Hudson W. P. de Carvalho’ya teşekkür etmek istiyor. Yazarlar ayrıca ışık mikroskobu tesisini sağladığı için Elektron Mikroskobu Laboratuvarı ”Prof. Elliot Watanabe Kitajima” ya minnettardır. Yazarlar, bitki materyaline lezyonlar sağladığı için Dr. Flávia Rodrigues Alves Patrício’ya teşekkür eder.

Materials

Blades DB80 HS Leica 14035838383 Sectioning
Cacodylate buffer EMS # 11652 Fixation
Cotton Blue Lactophenol Metaquímica 70SOLSIG024629 Staining
Formaldehyde EMS #15712 Fixation
Glutaraldehyde EMS #16216 Fixation
Historesin Kit Technovit /EMS #14653 Historesin for embedding
Hot plate Dubesser SSCD25X30-110V Staining
Microscopy Zeiss #490040-0030-000 Image capture
Microtome (Leica RM 2540) Leica 149BIO000C1 14050238005 Sectioning
Plastic molding cup tray EMS 10176-30 Staining
Ruthenium red LABHouse #006004 Staining
Software Axion Vision Zeiss #410130-0909-000 Image capture
Vaccum pump Prismatec 131 TIPO 2 V.C. Fixation
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. deBary, A. Research on the development of some parasitic fungi. Annals of Natural Sciences. Botany and Plant Biology. 20, 5 (1863).
  2. Mangin, L. Research on the Peronospores. Bulletin of the Natural History Society of Autun. 8, 55-108 (1895).
  3. Underwood, W. The plant cell wall: a dynamic barrier against pathogen invasion. Frontiers in Plant Science. 3 (85), 1-6 (2012).
  4. Hückelhoven, R. Cell wall-associated mechanisms of disease resistance and susceptibility. Annual Review of Phytopathology. 45, 101-127 (2007).
  5. Voigt, C. A. Callose-mediated resistance to pathogenic intruders in plant defense-related papillae. Frontiers in Plant Science. 5 (168), 1-6 (2014).
  6. Chowdhury, J., et al. Differential accumulation of callose, arabinoxylan and cellulose in nonpenetrated versus penetrated papillae on leaves of barley infected with Blumeria graminis f. sp. Hordei. New Phytologist. 204 (3), 650-660 (2014).
  7. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane cell wall-associated defense responses to infection by Sporisorium scitamineum. Frontiers in Plant Science. 9 (698), 1-14 (2018).
  8. Caffall, K. H., Mohnen, D. The structure, function, and biosynthesis of plant cell wall pectic polysaccharides. Carbohydrate Research. 344, 1879-1900 (2009).
  9. Carpita, N. C., Ralph, J., McCann, M. C. The cell wall. Biochemistry and Molecular Biology of Plants., 2nd Edition. , 45 (2015).
  10. Lionetti, V., Cervone, F., Bellincampi, D. Methyl esterification of pectin plays a role during plant-pathogen interactions and affects plant resistance to diseases. Journal of Plant Physiology. 169 (16), 1623-1630 (2012).
  11. Lionetti, V. Pectoplate: the simultaneous phenotyping of pectin methylesterases, pectinases, and oligogalacturonides in plants during biotic stresses. Frontiers in Plant Science. 6 (331), 1-8 (2015).
  12. Lionetti, V., et al. Three pectin methylesterase inhibitors protect cell wall integrity for Arabidopsis immunity to Botrytis. Plant Physiology. 173 (3), 1844-1863 (2017).
  13. Heath, M. C. Haustorium sheath formation in cowpea leaves immune to rust infection. Phytopathology. 61, 383-388 (1971).
  14. Silva, M. C., et al. Coffee resistance to the main diseases: leaf rust and coffee berry disease. Brazilian Journal of Plant Physiology. 18 (1), 119-147 (2006).
  15. An, P., Li, X., Zheng, Y., Eneji, A. E., Inanaga, S. Calcium effects on root cell wall composition and ion contents in two soybean cultivars under salinity stress. Canadian Journal of Plant Science. 94 (4), 733-740 (2014).
  16. Marques, J. P. R., et al. Sugarcane smut: shedding light on the development of the whip-shaped sorus. Annals of Botany. 119 (5), 815-827 (2017).
  17. Delaye, L., García-Guzmán, G., Heil, M. Endophytes versus biotrophic and necrotrophic pathogens-are fungal lifestyles evolutionarily stable traits. Fungal Diversity. 60 (1), 125-135 (2013).
  18. Avelino, J., et al. The coffee rust crises in Colombia and Central America (2008-2013): impacts, plausible causes and proposed solutions. Food Security. 7, 303-321 (2015).
  19. Zambolim, L. Current status and management of coffee leaf rust in Brazil. Tropical Plant Pathology. 41, 1-8 (2016).
  20. Swiderska-Burek, U., et al. Phytopathogenic Cercosporoidfungi-from taxonomy to modern biochemistry and molecular biology. International Journal of Molecular Sciences. 21 (22), 8555 (2020).
  21. Andrade, C. C. L., et al. Infection process and defense response of two distinct symptoms of Cercospora leaf spot in coffee leaves. Phytoparasitica. 49 (7), 727-737 (2021).
  22. Zambolim, L. Coffee tree diseases. Handbook of Phytopathology: Diseases of cultivated plants. 5th ed. , 810 (2016).
  23. Castaño, A. J. J. Coffee rust. Informative report Cenicafé. 82, 313-327 (1956).
  24. Echandi, E. Coffee rust, caused by the fungus Cercospora coffeicola. Turrialba. 9 (2), 54-67 (1959).
  25. Souza, A. G. C., Rodrigues, F. A., Maffia, L. A., Mizubuti, E. S. G. Infection process of Cercospora coffeicola on coffee leaf. Journal of Phytopathology. 159 (1), 6-11 (2011).
  26. Karnovsky, M. J. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolality for use in electron microscopy. Journal of Cell Biology. 27, 137-138 (1965).
  27. Hoagland, D. R., Arnon, D. I. The water-culture method for growing plants without soil. College of Agriculture, Agricultural Experiment Station. , 347 (1950).
  28. Eskes, A. B. Resistance. Coffee rust: epidemiology, resistance and management. 1, 171 (1989).
  29. Silva, M. C., Nicole, M., Rijo, L., Geiger, J. P., Rodrigues, C. G. Cytochemical aspects of the plant-rust fungus interface during the compatible interaction Coffea arabica (cv. Caturra)-Hemileia vastatrix (race III). International Journal of Plant Sciences. 160 (1), 79-91 (1999).
  30. Alves, R. F., Marques, J. P. R., Apezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Process of infection and colonization of Pseudocercospora kaki in persimmon leaves. Journal of Phytopathology. 169 (3), 168-175 (2020).
  31. Hayat, M. A. . Principles and Techniques of Electron Microscopy: Biological Applications, Vol. 1. , 564 (1981).
  32. Paiva, E. A. S., Pinho, S. Z., Oliveira, D. M. T., Chiarini-Garcia, H., Melo, R. C. N. Large plant samples: how to process for GMA embedding. Light microscopy: methods and protocols. 689, 37-49 (2011).
  33. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Appezzato-da-Glória, B. New staining technique for fungal-infected plant tissues. Turkish Journal of Botany. 37 (4), 784-787 (2013).
  34. Schuller, A., Ludwig-Müller, J. Histological methods to detect the clubroot pathogen Plasmodiophora brassicae during its complex life cycle. Plant Pathology. 65 (8), 1223-1237 (2016).
  35. Braga, Z. V., Santos, R. F., Amorim, L., Appezzato-da-Glória, B. Histopathological evidence of concomitant sexual and asexual reproduction of Elsinoë ampelina in grapevine under subtropical climate. Physiological and Molecular Plant Pathology. 111, 101517 (2020).
  36. Marques, J. P. R., Soares, M. K. M., Piracicaba, F. E. A. L. Q. . Manual of Techniques Applied to Plant Histopathology. , 140 (2021).
  37. Navarro, B. L., Marques, J. P. R., Appezzato-da-Glória, B., Spósito, M. B. Histopathology of Phakopsora euvitis on Vitis vinifera. European Journal of Plant Pathology. 154, 1185-1193 (2019).
  38. Chesters, C. G. C. Three methods of using cotton blue as a mycological stain. Annals of Botany. 48 (3), 820-822 (1934).
  39. Macedo, N. A. Manual of Techniques in Plant Histology. Feira de Santana: State University of Feira de Santana. , 68 (1997).
  40. Lecker, A. Preparation of lactophenol cotton blue slide mounts. Community Eye Health Journal. 12 (30), 24 (1999).
  41. Whitakaer, F. C. S., Denison, F. C. S. Lactic acid in wool dyeing. Journal of the Society of Dyers and Colourists. 98, 103 (1895).
  42. Chamberlain, C. J. . Methods in Plant Histology. , 349 (1932).
  43. Sterling, C. Crystal-structure of ruthenium red and stereochemistry of its pectin stain. American Journal of Botany. 57, 172-175 (1970).
  44. Luft, J. H. Ruthenium red and violet. 1. Chemistry, purification, methods of use for electron microscopy and mechanism of action. The Anatomical Record. 171 (3), 347-368 (1971).
  45. Buckeridge, M. S., Cavalari, A. A., Silva, G. B. D. A., Kerbauy, G. B. Cell Wall. Plant Physiology. , 165-181 (2013).

Tags

Double-stainingPectinPlant-fungus InteractionHistopathological StudiesCoffee RustCercosporiosisKarnovsky FixativeCacodylate BufferGlycol MethacrylatePolymerization
check_url/kr/63432?article_type=t&slug=double-staining-method-to-detect-pectin-in-plant-fungus-interaction

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Marques, J. P. R., Nuevo, L. G. Double-Staining Method to Detect Pectin in Plant-Fungus Interaction. J. Vis. Exp. (180), e63432, doi:10.3791/63432 (2022).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image