고함량 스크리닝 및 분석 응용을 위한 구상체의 대규모 생산을 위한 강력한 방법

요약

이 프로토콜은 대규모 고함량 스크리닝 및 분석에 적합한 방식으로 세 가지 유형의 구상체를 생산하는 방법을 자세히 설명합니다. 또한, 이들이 스페로이드 및 개별 세포 수준에서 어떻게 분석될 수 있는지를 보여주는 예들이 제시된다.

초록

고함량 스크리닝 (HCS) 및 고함량 분석 (HCA)은 연구자들에게 세포에서 대규모 정량적 표현형 측정을 추출 할 수있는 능력을 제공하는 기술입니다. 이 접근법은 세포 생물학에서 근본적인 사건과 적용된 사건의 광범위한 범위에 대한 우리의 이해를 깊게하는 데 강력한 것으로 입증되었습니다. 현재까지이 기술에 대한 대부분의 응용 프로그램은 단층에서 자란 세포의 사용에 의존해 왔지만 그러한 모델이 조직에서 발생하는 많은 상호 작용 및 과정을 재검토하지 않는다는 것이 점점 더 실현되고 있습니다. 이와 같이, 구상체 및 오가노이드와 같은 3차원(3D) 세포 어셈블리의 개발 및 사용에 있어서 출현이 있었다. 이러한 3D 모델은 암 생물학 및 약물 전달 연구의 맥락에서 특히 강력하지만, HCS 및 HCA에 적합한 재현 가능한 방식으로 생산 및 분석하는 것은 많은 도전 과제를 제시합니다. 여기에 상술된 프로토콜은 다세포 종양 구상체(MCTS)의 생성을 위한 방법을 설명하고, HCS 및 HCA와 양립가능한 방식으로 세 개의 상이한 세포주에 적용될 수 있음을 입증한다. 이 방법은 웰 당 수백 개의 구상체의 생산을 용이하게하며, 스크리닝 정권에서 사용될 때 웰 당 수백 개의 구조물로부터 데이터를 얻을 수 있으며 모두 동일한 방식으로 처리 할 수 있다는 특별한 이점을 제공합니다. 고분해능 형광 이미징을 위해 구상체를 처리하는 방법과 HCA가 각 스페로이드 내의 개별 세포뿐만 아니라 스페로이드 수준에서 정량적 특징을 추출하는 방법을 자세히 설명하는 예도 제공됩니다. 이 프로토콜은 세포 생물학에서 중요한 질문의 넓은 범위에 대답하기 위해 쉽게 적용될 수 있습니다.

서론

전통적으로, 세포-기반 분석은 고체 기질 상에서 성장하는 단층에서 수행되었으며, 이는 효과적으로 2차원(2D) 환경으로서 고려될 수 있다. 그러나, 2D 세포 배양 모델은 일부 맥락에서 생리학적 관련성이 결여되어 세포들 사이에서 발생하는 많은 복잡한 상호작용을 복제할 수 없다는 것이 점점 더 인식되고 있다¹. 3차원(3D) 세포 배양 방법은 연구자들 사이에서 빠르게 인기를 얻고 있으며, 3D 세포 모델은 조직 환경에서 세포가 직면하는 생리적 조건을 더 잘 모방할 수 있는 높은 잠재력을 보여준다². 사용 된 3D 셀 어셈블리에는 여러 가지 유형이 있지만 가장 일반적인 두 가지 유형은 구상체와 오가노이드입니다. 구상체는 다양한 세포주에서 성장할 수 있으며, 사용되는 세포 유형과 조립 방법에 따라 다양한 모양과 크기를 채택 할 수 있습니다³. 더욱이, 구상체는 또한 이들이 암 세포주로부터 성장할 때 다세포 종양 구상체 (MCTS)로 지칭될 수 있으며, 이들 모델은 전임상 시험관내 약물 전달 및 독성 연구에 특히 사용되는 것을 발견하였다^4,5. 반면에 ....

프로토콜

1. 세포 배양

1. 미디어 준비
   1. 세포주의 종류에 따라 특정 세포 배양 배지를 준비한다. 세포 유지를 위한 모든 배지에 10% 태아 소 혈청(FBS)이 포함되어 있는지 확인하십시오.
      참고: 다른 세포주는 다른 배지를 사용합니다. HT-29 결장 암종 세포 (ATCC HTB-38)는 맥코이스 5A + 10% FBS에서 성장한다. HepG2 간세포암종 세포(ATCC HB-8065)는 최소 필수 배지 + 1% L-글루타민 + 10% FBS에서 성장한다. H358 기관지 폐포 암종 세포 (ATCC CRL-5807)는 RPMI 1640 배지 + 1% L-글루타민 + 10% FBS에서 성장한다. L-글루타민과 FBS를 포함하는 모든 배지는 완전한 배지로 지칭된다. 세포를 도금하여 구상체로 성장할 때, ECM 지하실 물질의 착색을 피하기 위해 10 % FBS가있는 페놀 적색이없는 배지가 필요하며, 이는 이미징 과정에서 아티팩트를 유발할 수 있습니다.
2. 계대 배양 세포
   1. 세포가 약 80% 합류할 때, 2mL의 트립신-EDTA(0.25% (w/v) 트립신/0.53 mM EDTA)로 간단히 세척하십시오. 트립신-EDTA를 흡인하고, 신선한 트립신-EDTA 3 mL를 첨가하고, 37°C에서 3-5분....

결과

이 프로토콜에서는 다양한 종양 조직을 표현하기 위해 다양한 세포 유형을 사용하여 구상체 형태의 3D 세포 배양 어셈블리를 생산하는 강력한 방법이 자세히 설명되어 있습니다. 이 방법을 사용하면 웰 당 수백 개의 구상체를 생성 할 수 있으므로 세포 기반 분석을 고함량 방식으로 수행 할 수 있습니다 (그림 1). 이 접근법은 이전에 HT-29 구상체¹⁶ 에서의 나노입자 흡수 및 HepG2 구상체¹⁷에서의 나노입자-유도 독성을 연구하는데 사용되어 왔다. 이 방법은 광학 품질 플레이트의 우물 바닥을 가로 질러 스캐폴드 재료의 얇고 균일 한 분포를 생산하는 데 의존합니다. 세포는 각 웰에 시딩되고, 더 나아가 스캐폴드 물질은, 낮은 농도에서, 세포 상에 오버레이로서 첨가된다. 이것은 구상체의 성장도 지원하는 염기를 초래하며, 이는 수백 개의 구상체가 96-웰 플레이트의 각 웰에서 배양될 수 있음을 의미.......

토론

여기에 설명된 접근법은 HCS 및 HCA에 적합한 방식으로 웰당 수백 개의 구상체를 생성하기 위한 플랫폼을 상세히 설명한다. 웰 당 하나의 스페로이드 형성 만 허용하는 평평한 바닥 및 둥근 바닥 ULA 플레이트의 사용과 같은 다른 인기있는 방법과 비교할 때^,18,19,이 방법은 스크리닝 형식으로 많은 수의 구상체로부터 고해상도 정보를 추출 할 수있는 기회를 제공합니다. 특히,이 방법은 다양한 종양 유형을 나타내는 3 개의 다른 세포주에서 입증되었으며, 다양한 모델에서 다양한 세포 과정을 연구하는 데 광범위한 적합성을 강조합니다. 이 방법을 사용하여 생성 된 구상체는 크기와 모양에 약간의 변동성을 보여 주지만 HCA는 크기 (또는 관심있는 다른 매개 변수)별로 쉽게 분류 할 수 있습니다. 우리 실험실은이 접근법을 성공적으로 사용하여 스페로이드 크기의 함수로서 나노 입자 유도 독성을 연구했습니다. 중요하게도, 구상체의 모든 상이.......

재료

이 논문에 사용된 재료 목록

이름	회사	카탈로그 번호	댓글
0.05% 트립신-EDTA (1x), 페놀 레드	Gibco	25300054
소 혈청 알부민(BSA)	시그마 알드리치	A6003
염화칼슘	Fisher Scientific	10050070
Cellular Scientific 울트라 마이크로플레이트, 조직 배양 처리, 검정색, 96웰(뚜껑 포함	Perkin Elmer	6055302	이 플레이트는 Phenoplates
로 이름이 변경되었습니다.Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma Aldrich	D2650
Foetal Bovine Serum (FBS), 적격, EU 승인, 남미 원산지, 열 비활성화	Gibco	10500064
Glycine	Fisher Scientific	BP381-1
염소 항-마우스 IgG (H+L) 고도의 교차 흡착 2차 항체, Alexa Fluor 488	Invitrogen	A-11029
L-Glutamine 용액, 200 mM	Gibco	25030024
Hoechst 33342	Sigma Aldrich	14533
염화마그네슘	Fisher Scientific	10647032
Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL	Corning	356237	이 Matrigel 제형은 BD Biosciences
Matrigel Growth Factor Reduced에서 동일한 카탈로그 번호로 찾을 수 있습니다. Matrigel	BD Biosciences	356231	이 Matrigel 제형은 Corning
McCoy의 5A 배지	Gibco	26600023
McCoy의 5A 배지 with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red	Hyclone	10358633
Minimum Essential Medium (MEM)	Gibco	21090022
에서도 동일한 카탈로그 번호로 찾아볼 수 있습니다최소 필수 배지(MEM), 글루타민 없음, 페놀 레드	없음 Gibco 51200046
Mouse monoclonal anti-LAMP1 항체(농축액)	개발 연구 Hybridoma Bank	H4A3-a
Neubauer counting chamber	Hirschmann	8100203
Nunclon tissue culture dish with lid, 폴리스티렌, 92 mm x 17 mm	ThermoFisher Scientific	150350
Opera Phoenix HCS 시스템 및 Harmony HCA 소프트웨어	Perkin Elmer	HCSHH14000000
파라포름알데히드(PFA)	Sigma Aldrich	P6148
Phalloidin Alexa Fluor 568	Invitrogen	A12380
Phosphate Buffered Saline (PBS) 정제	Sigma Aldrich	P4417
폴리소르베이트 20	Sigma Aldrich	P5927
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement	Gibco	61870010
RPMI 1640 Medium, 글루타민 미포함, 페놀 레드	없음 Gibco	11835063
Triton X-100	Sigma Aldrich	T9284
Stericup 멸균 진공 필터 장치	Millipore	SCGVU05RE

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