En robust metode til storstilet produktion af sfæroider til screenings- og analyseapplikationer med højt indhold
Summary
Denne protokol beskriver en metode til fremstilling af tre forskellige typer sfæroider på en måde, der gør dem egnede til storstilet screening og analyse af højt indhold. Derudover præsenteres eksempler, der viser, hvordan de kan analyseres på sfæroid- og individuelle celleniveauer.
Abstract
High-content screening (HCS) og high-content analysis (HCA) er teknologier, der giver forskere mulighed for at udtrække store kvantitative fænotypiske målinger fra celler. Denne tilgang har vist sig at være stærk til at uddybe vores forståelse af en bred vifte af både grundlæggende og anvendte begivenheder inden for cellebiologi. Hidtil har de fleste applikationer til denne teknologi været afhængige af brugen af celler dyrket i monolag, selv om det i stigende grad indses, at sådanne modeller ikke rekapitulerer mange af de interaktioner og processer, der forekommer i væv. Som sådan har der været en fremkomst i udviklingen og brugen af 3-dimensionelle (3D) cellesamlinger, såsom sfæroider og organoider. Selvom disse 3D-modeller er særligt kraftfulde i forbindelse med kræftbiologi og lægemiddelleveringsundersøgelser, udgør deres produktion og analyse på en reproducerbar måde, der er egnet til HCS og HCA, en række udfordringer. Protokollen, der er beskrevet her, beskriver en metode til generering af multicellulære tumorsfæroider (MCTS) og viser, at den kan anvendes på tre forskellige cellelinjer på en måde, der er kompatibel med HCS og HCA. Metoden letter produktionen af flere hundrede sfæroider pr. brønd, hvilket giver den specifikke fordel, at når de anvendes i et screeningsregime, kan data opnås fra flere hundrede strukturer pr. Brønd, alle behandlet på samme måde. Der gives også eksempler, som beskriver, hvordan man behandler sfæroiderne til fluorescensbilleddannelse i høj opløsning, og hvordan HCA kan udtrække kvantitative træk på både sfæroidniveau såvel som fra individuelle celler inden for hver sfæroid. Denne protokol kunne let anvendes til at besvare en lang række vigtige spørgsmål inden for cellebiologi.
Introduction
Traditionelt er cellebaserede assays blevet udført i monolag, der vokser på et fast substrat, hvilket effektivt kan betragtes som et todimensionelt (2D) miljø. Det bliver dog i stigende grad anerkendt, at 2D-cellekulturmodeller mangler fysiologisk relevans i nogle sammenhænge og ikke kan replikere mange af de komplekse interaktioner, der forekommer mellem celler1. Tredimensionelle (3D) cellekulturmetoder bliver hurtigt populære blandt forskere, og 3D-cellemodeller viser et stort potentiale til bedre at efterligne de fysiologiske tilstande, som celler støder på i vævsmiljøet2. Der er flere forskellige typer af 3D-cellesamlinger, der er blevet anvendt, men de to mest almindelige typer er sfæroider og organoider. Sfæroider kan dyrkes fra mange forskellige cellelinjer, og de kan antage forskellige former og størrelser afhængigt af den anvendte celletype og deres samlemetode3. Desuden kan sfæroider også betegnes som multicellulære tumorsfæroider (MCTS), når de dyrkes fra kræftcellelinjer, og disse modeller har fundet særlig anvendelse til prækliniske in vitro-lægemiddelleverings– og toksicitetsundersøgelser4,5. Organoider sigter derimod mod bedre at efterligne væv og organer i vores krop og kan vedtage mere komplekse morfologiske arrangementer. Produktionen af organoider indebærer anvendelse af voksne stamceller eller pluripotente stamceller, som kan omprogrammeres til de relevante celler for at ligne det væv eller organ, der er af interesse. De bruges primært til at undersøge udviklingen af organer og til at modellere sygdomme og værtspatogeninteraktioner6.
Der er en række forskellige metoder, der bruges til at generere 3D-cellesamlinger. Stilladsbaserede metoder giver et substrat eller en støtte, som celler enten kan fastgøre eller vokse indenfor. Disse stilladser kan have forskellige former og kan laves af en række forskellige materialer. De mest almindelige er ekstracellulære matrixkomponenter (ECM) og hydrogeler, og de er designet til at ligne cellernes naturlige ekstracellulære miljø og derved lette fysiologiske interaktioner4,7. ECM kældermateriale er blevet ekstraheret fra Engelbreth-Holm-Swarm musesarkomtumor og vist sig at indeholde en rig blanding af ECM-komponenter, herunder laminin, type IV kollagen og perlecan8. På trods af dets fordelagtige sammensætning er der imidlertid to hovedudfordringer ved dets anvendelse, nemlig dets batch-til-batch-variabilitet, og at det har to forskellige aggregerede tilstande under og over 10 °C8,9. I modsætning hertil har hydrogeler den fordel, at de er fleksible med hensyn til deres komponenter og stivhed, og de kan tilpasses, så de passer til den specifikke ønskede 3D-cellesamling7,10. Stilladsbaserede metoder er afgørende for organoidvækst, men anvendes også i vid udstrækning til sfæroider. Stilladsfrie metoder, der virker ved at forhindre celler i at binde sig til den overflade, de vokser på, er normalt kun kompatible med sfæroidsamling. Eksempler herpå er plader med ultralav fastgørelse (ULA) med enten en flad bund eller U-bund, som tillader aggregering af cellerne i sfæroider, eller anvendelse af kontinuerlig omrøring af cellerne i spinner-/rotationskolber10.
Brugen af 3D-cellesamlinger til at studere en lang række biologiske begivenheder vinder hurtigt popularitet; Det er imidlertid afgørende, at den metode, der er valgt for deres kultur, er hensigtsmæssig og forenelig med planerne for deres downstream-analyse. For eksempel genererer brugen af ULA-plader sfæroider med høj konsistens; Denne metode er imidlertid begrænset til produktion af en enkelt sfæroid pr. Brønd og derved begrænser gennemstrømningen. Der er behov for særlig overvejelse, når fluorescensbilleddannelse af 3D-strukturen er planlagt. Underlaget eller pladen, som samlingen dyrkes på, skal være optisk kompatibel, og der skal udvises omhu for at minimere virkningerne af lysspredning forårsaget af stilladser, der måtte have været brugt11. Dette særlige problem bliver mere akut, efterhånden som den numeriske blænde på mikroskopets objektive linser øges.
Formentlig er en af hovedårsagerne til at vælge at arbejde med en 3D-cellemodel at udtrække volumetriske billeddannelsesdata om ikke kun hele samlingen, men også de enkelte celler i den. Især MCTS-modeller begynder at vise sig at være meget kraftfulde til at uddybe vores forståelse af, hvordan terapi passerer udefra til centrale celler (som de ville have brug for i en tumor)12, og derfor er det vigtigt at få viden fra individuelle celler i forskellige lag. Billeddannelsesteknologien, der udtrækker kvantitativ information fra individuelle celler, kaldes high-content analysis (HCA) og er en stærk tilgang i forbindelse med screening13. Hidtil er HCA næsten udelukkende blevet anvendt på monolagskulturer, men der er en stigende erkendelse af, at denne tilgang har magt til at blive anvendt på 3D-kulturer, hvilket gør det muligt at studere en bred vifte af cellulære funktioner og processer14. Det ville have den klare fordel, at et stort antal 3D-samlinger kunne analyseres, hvilket potentielt kunne give data på celleniveau fra hele hver struktur. Udfordringer forbundet med billeddannelse af potentielt tykke cellesamlinger såvel som de store datasæt, der genereres, skal imidlertid overvindes.
I denne artikel præsenteres en robust stilladsbaseret metode til storstilet produktion af MCTS i et 96-brønds format. Metoden letter produktionen af flere hundrede 3D-cellesamlinger i hver brønd. Eksempler er vist for tre forskellige celletyper, der repræsenterer solide tumormodeller af leveren, lungen og tyktarmen. De sfæroider, der dannes, kan være af forskellig størrelse, og derfor bruges HCA til at vælge strukturer af en bestemt størrelse og / eller morfologi. Denne funktion giver den ekstra fordel, at eventuelle fænotyper, der observeres, kan sammenlignes på tværs af sfæroider i forskellige størrelser, men alle behandles på samme måde i samme brønd. Denne tilgang er kompatibel med billeddannelse i høj opløsning, hvilket er vigtigt at give kvantitative data på både celleniveau og subcellulært niveau fra de samme cellulære samlinger. Denne metode til sfæroidproduktion har den yderligere fordel i forhold til metoder, der genererer en enkelt sfæroid pr. Brønd, at det store antal sfæroider, der produceres i hver brønd, potentielt giver tilstrækkelig biomasse til andre downstream-analyser, såsom transkriptom og proteomprofilering.
Protocol
Representative Results
Discussion
Den tilgang, der er beskrevet her, beskriver en platform til generering af flere hundrede sfæroider pr. Brønd på en måde, der er egnet til HCS og HCA. I sammenligning med andre populære metoder, såsom brugen af fladbundede og rundbundede ULA-plader, som kun tillader dannelse af en sfæroid pr. Brønd18,19, giver denne metode mulighed for, at information i høj opløsning kan ekstraheres fra et stort antal sfæroider i et screeningsformat. Især er denne met…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Forfatterne anerkender støtten fra en infrastrukturforskningsbevilling fra Science Foundation Ireland (SFI) (16 / RI / 3745) til JCS. Arbejdet i UCD Cell Screening Laboratory støttes af UCD College of Science. ASC finansieres af et irsk forskningsråd (IRC) Irlands regering Postgraduate Scholarship (GOIPG / 2019/68). Forfatterne takker også alle medlemmer af laboratoriet for deres input og nyttige diskussioner. Kunstværket i figur 1 blev genereret i BioRender.
Materials
| 0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
| Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
| Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
| CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
| Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
| Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
| Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
| L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
| Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
| Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
| Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
| Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
| McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
| McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
| Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
| Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
| Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
| Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
| Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
| Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
| Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
| Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
| RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
| RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |
References
- Jensen, C., Teng, Y. Is it time to start transitioning from 2D to 3D cell culture. Frontiers in Molecular Biosciences. 7, 33 (2020).
- Langhans, S. A. Three-dimensional in vitro cell culture models in drug discovery and drug repositioning. Frontiers in Pharmacology. 9, 6 (2018).
- Edmondson, R., Broglie, J. J., Adcock, A. F., Yang, L. Three-dimensional cell culture systems and their applications in drug discovery and cell-based biosensors. Assay and Drug Development Technologies. 12 (4), 207-218 (2014).
- Lv, D., Hu, Z., Lu, L., Lu, H., Xu, X. Three-dimensional cell culture: A powerful tool in tumor research and drug discovery. Oncology Letters. 14 (6), 6999-7010 (2017).
- Zhang, X., Jiang, T., Chen, D., Wang, Q., Zhang, L. W. Three-dimensional liver models: state of the art and their application for hepatotoxicity evaluation. Critical Reviews in Toxicology. 50 (4), 279-309 (2020).
- Dutta, D., Heo, I., Clevers, H. Disease modeling in stem cell-derived 3D organoid systems. Trends in Molecular Medicine. 23 (5), 393-410 (2017).
- Nunes, A. S., Barros, A. S., Costa, E. C., Moreira, A. F., Correia, I. J. 3D tumor spheroids as in vitro models to mimic in vivo human solid tumors resistance to therapeutic drugs. Biotechnology and Bioengineering. 116 (1), 206-226 (2019).
- Kleinman, H. K., Martin, G. R. Matrigel: Basement membrane matrix with biological activity. Seminars in Cancer Biology. 15, 378-386 (2005).
- Caliari, S. R., Burdick, J. A. A practical guide to hydrogels for cell culture. Nature Methods. 13 (5), 405-414 (2016).
- Foglietta, F., Canaparo, R., Muccioli, G., Terreno, E., Serpe, L. Methodological aspects and pharmacological applications of three-dimensional cancer cell cultures and organoids. Life Sciences. 254, 117784 (2020).
- Bardsley, K., Deegan, A. J., El Haj, A., Yang, Y. Current state-of-the-art 3D tissue models and their compatibility with live-cell imaging. Advances in Experimental Medicine and Biology. 1035, 3-18 (2017).
- Darrigues, E., et al. Tracking gold nanorods’ interaction with large 3D pancreatic-stromal tumor spheroids by multimodal imaging: Fluorescence, photoacoustic, and photothermal microscopies. Scientific Reports. 10 (1), 3362 (2020).
- Boutros, M., Heigwer, F., Laufer, C. Microscopy-based high-content screening. Cell. 163 (6), 1314-1325 (2015).
- Mysior, M. M., Simpson, J. C. Cell3: A new vision for study of the endomembrane system in mammalian cells. Bioscience Reports. , (2021).
- Nürnberg, E., et al. Routine optical clearing of 3D-cell cultures: Simplicity forward. Frontiers in Molecular Biosciences. 7 (20), (2020).
- Cutrona, M. B., Simpson, J. C. A High-throughput automated confocal microscopy platform for quantitative phenotyping of nanoparticle uptake and transport in spheroids. Small. 15 (37), 1902033 (2019).
- Kelly, S., Byrne, M. H., Quinn, S. J., Simpson, J. C. Multiparametric nanoparticle-induced toxicity readouts with single cell resolution in HepG2 multicellular tumour spheroids. Nanoscale. 13 (41), 17615-17628 (2021).
- Sirenko, O., Mitlo, T., Hesley, J., Luke, S., Owens, W., Cromwell, E. F. High-content assays for characterizing the viability and morphology of 3D cancer spheroid cultures. Assay and Drug Development Technologies. 13 (7), 402-414 (2015).
- Redondo-Castro, E., Cunningham, C. J., Miller, J., Cain, S. A., Allan, S. M., Pinteaux, E. Generation of human mesenchymal stem cell 3D spheroids using low-binding plates. Bio-protocol. 8 (16), (2018).
- Lee, G. Y., Kenny, P. A., Lee, E. H., Bissell, M. J. Three-dimensional culture models of normal and malignant breast epithelial cells. Nature Methods. 4 (4), 359-365 (2007).
- Eismann, B., et al. Automated 3D light-sheet screening with high spatiotemporal resolution reveals mitotic phenotypes. Journal of Cell Science. 133 (11), 245043 (2020).
- Alsehli, H., et al. An integrated pipeline for high-throughput screening and profiling of spheroids using simple live image analysis of frame to frame variations. Methods. 190, 33-43 (2021).
- Stirling, D. R., et al. CellProfiler 4: improvements in speed, utility and usability. BMC Bioinformatics. 22 (1), 1-11 (2021).
- Renner, H., et al. A fully automated high-throughput workflow for 3D-based chemical screening in human midbrain organoids. eLife. 9, 52904 (2020).
- Powley, I. R., et al. Patient-derived explants (PDEs) as a powerful preclinical platform for anti-cancer drug and biomarker discovery. British Journal of Cancer. 122 (6), 735-744 (2020).
- Collins, A., Miles, G. J., Wood, J., MacFarlane, M., Pritchard, C., Moss, E. Patient-derived explants, xenografts and organoids: 3-dimensional patient-relevant preclinical models in endometrial cancer. Gynecologic Oncology. 156 (1), 251-259 (2020).
- Miles, G. J., et al. Evaluating and comparing immunostaining and computational methods for spatial profiling of drug response in patient-derived explants. Laboratory Investigation. 101 (3), 396-407 (2021).
