פרוטוקול זה מפרט שיטה לייצור של שלושה סוגים שונים של כדוריות באופן שהופך אותם מתאימים להקרנה וניתוח תוכן גבוה בקנה מידה גדול. בנוסף, מוצגות דוגמאות המראים כיצד ניתן לנתח אותם ברמות של כדורי ותאים בודדים.
סינון תוכן גבוה (HCS) וניתוח תוכן גבוה (HCA) הן טכנולוגיות המספקות לחוקרים את היכולת לחלץ מדידות פנוטיפיות כמותיות בקנה מידה גדול מתאים. גישה זו הוכיחה את עצמה כבעלת עוצמה להעמקת הבנתנו במגוון רחב של אירועים בסיסיים ויישומיים בביולוגיה של התא. עד כה, רוב היישומים עבור טכנולוגיה זו הסתמכו על השימוש בתאים הגדלים monolayers, אם כי הוא הבין יותר ויותר כי מודלים כאלה אינם מסכמים רבים של אינטראקציות ותהליכים המתרחשים ברקמות. ככזה, חלה הופעתה בהתפתחות ושימוש במכלולי תאים תלת מימדיים (3D), כגון כדוריות ואורגנוידים. למרות שמודלים תלת-ממדיים אלה חזקים במיוחד בהקשר של ביולוגיה של סרטן ומחקרי אספקת תרופות, הייצור והניתוח שלהם באופן ניתן לשחזור המתאים ל- HCS ו- HCA מציבים מספר אתגרים. הפרוטוקול המפורט כאן מתאר שיטה ליצירת כדוריות גידול רב-תאיות (MCTS), ומדגים כי ניתן להחיל אותה על שלושה קווי תאים שונים באופן התואם את HCS ו- HCA. השיטה מאפשרת ייצור של כמה מאות כדוריות לבאר, ומספקת את היתרון הספציפי שכאשר משתמשים בו במשטר סינון, ניתן להשיג נתונים מכמה מאות מבנים לבאר, כולם מטופלים באופן זהה. דוגמאות מסופקות גם, המפרטות כיצד לעבד את הספרואידים להדמיית פלואורסצנטיות ברזולוציה גבוהה וכיצד HCA יכול לחלץ תכונות כמותיות הן ברמת הספרואיד והן מתאים בודדים בתוך כל ספרואיד. פרוטוקול זה יכול בקלות להיות מיושם כדי לענות על מגוון רחב של שאלות חשובות בביולוגיה של התא.
באופן מסורתי, בדיקות מבוססות תאים בוצעו ב-monolayers הגדלים על מצע מוצק, אשר למעשה יכול להיחשב כסביבה דו-ממדית (דו-ממדית). עם זאת, זה הופך להיות מוכר יותר ויותר כי מודלים תרבית תאים 2D חסר רלוונטיות פיזיולוגית בהקשרים מסוימים ולא יכול לשכפל רבים של אינטראקציות מורכבות המתרחשות בין תאים1. שיטות תלת-ממדיות (תלת-ממדיות) של תרבית תאים הופכות במהירות לפופולריות בקרב החוקרים, ומודלים של תאים תלת-ממדיים מראים פוטנציאל גבוה לחקות טוב יותר את התנאים הפיזיולוגיים בהם נתקלים התאים בסביבת הרקמה2. ישנם מספר סוגים שונים של מכלולי תאים תלת-ממדיים שהועסקו, אך שני הסוגים הנפוצים ביותר הם כדוריות ואורגנוידים. ניתן לגדל כדורים מקווי תאים רבים ושונים, והם יכולים לאמץ צורות וגדלים שונים בהתאם לסוג התא המשמש ולשיטת ההרכבה שלהם3. יתר על כן, spheroids יכול גם להיקרא spheroids גידול רב תאי (MCTS) כאשר הם גדלים מקווי תאים סרטניים, ומודלים אלה מצאו שימוש מיוחד עבור משלוח תרופות הפריה-קלינית במבחנה ומחקרי רעילות4,5. Organoids, לעומת זאת, שואפים לחקות טוב יותר את הרקמות והאיברים בגוף שלנו והוא יכול לאמץ סידורים מורפולוגיים מורכבים יותר. הייצור של organoids כרוך בשימוש בתאי גזע בוגרים או תאי גזע pluripotent, אשר ניתן לתכנת מחדש לתוך התאים המתאימים כדי להידמות לרקמה או איבר העניין. הם משמשים בעיקר כדי לחקור את התפתחות האיברים וכדי מודל מחלות ואינטראקציות מארח-פתוגן6.
יש מגוון של שיטות שונות המשמשות ליצירת הרכבות תאים תלת-ממדיות. שיטות מבוססות פיגומים מספקות מצע או תמיכה שבהם תאים יכולים להיצמד או לגדול בתוכם. פיגומים אלה יכולים להיות צורות שונות והוא יכול להיעשות ממגוון רחב של חומרים שונים. הנפוצים ביותר הם רכיבי מטריצה חוץ-תאית (ECM) והידרו-ג’לים, והם נועדו להידמות לסביבה החוץ-תאית הטבעית של התאים ובכך להקל על אינטראקציות פיזיולוגיות4,7. חומר מרתף ECM הופק מגידול סרקומה עכבר אנגלברט-הולם-נחיל והוכח שהוא מכיל תערובת עשירה של רכיבי ECM, כולל למינין, קולגן מסוג IV ופרלקן8. עם זאת, למרות הרכב היתרון שלה, ישנם שני אתגרים עיקריים עם השימוש בו, כלומר שונות אצווה לאצווה שלה וכי יש לו שני מצבים מצרפיים שונים מתחת ומעל 10 °C8,9. לעומת זאת, הידרוג’לים יש את היתרון של להיות גמיש ביחס לרכיבים שלהם קשיחות, והם יכולים להיות מותאמים אישית כדי להתאים את הרכבה ספציפית 3D התא הרצוי 7,10. שיטות מבוססות פיגומים חיוניות לצמיחת אורגנויד אך משמשות גם באופן נרחב עבור כדוריות. שיטות נטולות פיגומים, הפועלות על ידי מניעת הצמדת תאים לפני השטח שעליהם הם גדלים, תואמות בדרך כלל רק להרכבה כדורית. דוגמאות כוללות לוחות קובץ מצורף אולטרה-נמוך (ULA), עם תחתית שטוחה או U-bottom, המאפשרים צבירה של התאים לתוך spheroids, או שימוש בתסיסה מתמשכת של התאים בבקבוקי ספינר / סיבוב10.
השימוש במכלולי תאים תלת-ממדיים כדי לחקור מגוון רחב של אירועים ביולוגיים צובר במהירות פופולריות; עם זאת, זה חיוני כי השיטה שנבחרה עבור התרבות שלהם מתאימה ותואמת עם התוכניות לניתוח במורד הזרם שלהם. לדוגמה, השימוש בלוחות ULA יוצר כדוריות של עקביות גבוהה; עם זאת, שיטה זו מוגבלת לייצור של ספרואיד יחיד לבאר, ובכך להגביל את התפוקה. שיקול מסוים נדרש כאשר הדמיית פלואורסצנטיות של המבנה 3D מתוכנן. המצע או הצלחת שעליהם גדל ההרכבה צריכים להיות תואמים אופטית, ויש לנקוט משנה זהירות כדי למזער את ההשפעות של פיזור אור שנגרם על ידי פיגומים שאולי נעשה בהם שימוש11. בעיה מסוימת זו הופכת חריפה יותר ככל שהצמצם המספרי של עדשות המטרה של המיקרוסקופ עולה.
ניתן לטעון שאחת הסיבות העיקריות לבחירה לעבוד עם מודל תא תלת-ממדי היא לחלץ נתוני הדמיה נפחית לא רק על ההרכבה כולה אלא גם על התאים הבודדים שבתוכה. מודלים של MCTS, בפרט, מתחילים להיות חזקים מאוד להעמקת ההבנה שלנו כיצד טיפוליות עוברות מבחוץ לתאים מרכזיים (כפי שהם יצטרכו בגידול)12, ולכן רכישת ידע מתאים בודדים בשכבות שונות היא חיונית. טכנולוגיית ההדמיה המחלצת מידע כמותי מתאים בודדים נקראת ניתוח תוכן גבוה (HCA) והיא גישה רבת עוצמה בהקשר של סינון13. עד כה, HCA יושם כמעט אך ורק על תרבויות monolayer, אבל יש הבנה הולכת וגוברת כי גישה זו יש את הכוח להיות מיושם על תרבויות 3D המאפשר מגוון רחב של פונקציות ותהליכים הסלולר להיחקר14. זה יהיה היתרון הברור כי מספר גדול של הרכבות 3D ניתן לנתח, פוטנציאל מתן נתונים ברמת התא מכל מבנה. עם זאת, יש להתגבר על אתגרים הקשורים להדמיה של הרכבות תאים עבות פוטנציאליות, כמו גם את ערכות הנתונים הגדולות שנוצרו.
במאמר זה מוצגת שיטה חזקה המבוססת על פיגומים לייצור בקנה מידה גדול של MCTS בפורמט של 96 בארות. השיטה מאפשרת ייצור של כמה מאות מכלולי תאים תלת-ממדיים בכל באר. דוגמאות מוצגות עבור שלושה סוגי תאים שונים, המייצגים מודלים של גידול מוצק של הכבד, הריאות והמעי הגס. הספרואידים הנוצרים יכולים להיות במגוון גדלים, ולכן HCA משמש לבחירת מבנים בגודל ו/או מורפולוגיה מסוימים. תכונה זו מספקת את היתרון הנוסף כי כל פנוטיפים שנצפו ניתן להשוות על פני כדוריות בגדלים שונים, אבל כל מטופלים באותו אופן באותה באר. גישה זו תואמת הדמיה ברזולוציה גבוהה, וחשוב מכך מספקת נתונים כמותיים ברמת התא והן ברמת התא התת-תאית מאותן מכלולים תאיים. שיטה זו של ייצור כדורי יש יתרון נוסף על פני שיטות המייצרות ספרואיד יחיד לכל באר, כי המספרים הגדולים של spheroids המיוצר בכל באר פוטנציאל לספק ביומסה מספקת עבור ניתוחים אחרים במורד הזרם, כגון תמלול ופרופיל פרוטאום.
הגישה המתוארת כאן מפרטת פלטפורמה ליצירת כמה מאות כדוריות לבאר באופן המתאים ל- HCS ו- HCA. בהשוואה לשיטות פופולריות אחרות, כגון שימוש בלוחות ULA שטוחים עם תחתית ועגולה, המאפשרים היווצרות של ספרואיד אחד בלבד לכל well18,19, שיטה זו מספקת את ההזדמנות להפקת מידע ברזולוציה…
The authors have nothing to disclose.
המחברים מכירים בתמיכתו של מענק מחקר תשתית מקרן המדע אירלנד (SFI) (16/RI/3745) ל- JCS. העבודה במעבדה להקרנת תאים של UCD נתמכת על ידי המכללה למדעים של UCD. ASC ממומן על ידי מועצת המחקר האירית (IRC) ממשלת אירלנד מלגת תואר שני (GOIPG/2019/68). המחברים מודים גם לכל חברי המעבדה על הקלט והדיונים המועילים שלהם. הגרפיקה באיור 1 נוצרה ב-BioRender.
0.05% Trypsin-EDTA (1x), phenol red | Gibco | 25300054 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma Aldrich | A6003 | |
Calcium chloride | Fisher Scientific | 10050070 | |
CellCarrier-96 Ultra Microplates, tissue culture treated, black, 96-well with lid | Perkin Elmer | 6055302 | These plates have been renamed as Phenoplates |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | |
Foetal Bovine Serum (FBS), qualified, EU approved, South America origin, heat inactivated | Gibco | 10500064 | |
Glycine | Fisher Scientific | BP381-1 | |
Goat anti-Mouse IgG (H+L) Highly Cross-Adsorbed Secondary Antibody, Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A-11029 | |
L-Glutamine solution, 200 mM | Gibco | 25030024 | |
Hoechst 33342 | Sigma Aldrich | 14533 | |
Magnesium chloride | Fisher Scientific | 10647032 | |
Matrigel Basement Membrane Matrix, Phenol Red-free, LDEV-free, 10 mL | Corning | 356237 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at BD Biosciences |
Matrigel Growth Factor Reduced Matrigel | BD Biosciences | 356231 | This Matrigel formulation can be also found with the same catalogue number at Corning |
McCoy's 5A medium | Gibco | 26600023 | |
McCoy's 5A medium with L glutamine and sodium bicarbonate, without phenol red | Hyclone | 10358633 | |
Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 21090022 | |
Minimum Essential Medium (MEM), without glutamine, without phenol red | Gibco | 51200046 | |
Mouse monoclonal anti-LAMP1 antibody (concentrate) | Developmental Studies Hybridoma Bank | H4A3-a | |
Neubauer counting chamber | Hirschmann | 8100203 | |
Nunclon tissue culture dish with lid, polystyrene, 92 mm x 17 mm | ThermoFisher Scientific | 150350 | |
Opera Phenix HCS System and Harmony HCA software | Perkin Elmer | HCSHH14000000 | |
Paraformaldehyde (PFA) | Sigma Aldrich | P6148 | |
Phalloidin Alexa Fluor 568 | Invitrogen | A12380 | |
Phosphate Buffered Saline (PBS) tablets | Sigma Aldrich | P4417 | |
Polysorbate 20 | Sigma Aldrich | P5927 | |
RPMI 1640 Medium, GlutaMAX Supplement | Gibco | 61870010 | |
RPMI 1640 Medium, without glutamine, without phenol red | Gibco | 11835063 | |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
Stericup sterile vacuum filter units | Millipore | SCGVU05RE |