أخذ عينات الدم المتكررة من الوريد تحت الترقوة للفأر الواعي
Summary
يصف البروتوكول الحالي طريقة بسيطة وفعالة لجمع الدم من الوريد تحت الترقوة في الفئران. إنه يتيح أخذ عينات سريعة وفي الوقت المناسب ويمكن التعرف عليها بسهولة دون تخدير ويحصل على دم عالي الجودة من خلال جمع العينات المتكررة.
Abstract
تستخدم الفئران على نطاق واسع في دراسات الحرائك الدوائية (PK) ودراسات الحركية السمية (TK) التي تحتاج إلى جمع كمية معينة من الدم في نقاط زمنية محددة للكشف عن التعرض للمخدرات. تحدد طريقة أخذ عينات دم الفئران جودة البلازما وتؤثر بشكل أكبر على دقة نتائج الاختبار. تقوم طريقة جمع دم الوريد تحت الترقوة الموصوفة في هذا البروتوكول بجمع عينات الدم بشكل متكرر في الحالة الواعية للحيوانات لتلبية احتياجات اختبارات PK و TK. تضمن مهارات التعامل مع ضبط النفس والإجراء المناسب لشق الإبرة معدل نجاح جمع الدم. إنه سهل التشغيل مع ضمان جودة البلازما وفي نفس الوقت تلبية رعاية الحيوان. ومع ذلك ، تتطلب هذه الطريقة عملية ماهرة ، وقد تتسبب الطريقة غير المناسبة في ضعف الحيوانات والألم والعرج وحتى الوفيات. تم استخدام الطريقة الحالية في مرفق الاختبار لدراسة السمية الفموية لمدة 4 أسابيع في فئران Sprague Dawley (SD) مع TK. لم يتجاوز الحد الأقصى لكمية الدم التي تم جمعها خلال 24 ساعة 20٪ من إجمالي دم الحيوان. كان وزن جسم الحيوانات أكثر من 200 غرام للذكور والإناث. أظهرت البيانات أن وزن جسم الحيوانات يزداد بشكل مطرد كل أسبوع ، وكانت الملاحظة السريرية طبيعية بعد جمع العينات المتكررة.
Introduction
وفقا للمبادئ التوجيهية1 للمؤتمر الدولي المعني بتنسيق المتطلبات التقنية لتسجيل المستحضرات الصيدلانية للاستخدام البشري (ICH) والمبادئ التوجيهية2 للإدارة الوطنية للمنتجات الطبية (NMPA) ، يجب أن يفي عدد النقاط الزمنية لجمع الدم للفئران في دراسة الحركية السمية (TK) بمتطلبات التقييم الديناميكي للتعرض للأدوية. إجمالي حجم الدم التقريبي للفأر هو 55-70 مل / كجم من وزن الجسم3. تكون النقاط الزمنية للجمع مكثفة بشكل عام في غضون 30 دقيقة بعد الجرعات وتنخفض بعد ذلك ، ويجب جمع أكثر من عشر عينات دم في غضون 48 ساعة في الاختبار الروتيني4. على سبيل المثال ، يتم جمع عينات الدم في 12 نقطة زمنية (0 دقيقة ، 5 دقائق ، 10 دقائق ، 15 دقيقة ، 30 دقيقة ، 45 دقيقة ، 1 ساعة ، 2 ساعة ، 3 ساعات ، 4 ساعات ، 8 ساعات ، و 12 ساعة) في دراسة المعارف التقليدية للعقاقير التي يتم تناولها عن طريق الفم. يجب على الباحثين جمع 200-250 ميكرولتر من الدم بشكل متكرر في الفئران للحصول على بلازما عالية الجودة لاختبار المعارف التقليدية5.
تشمل مواقع جمع الدم في الفئران الأوعية الدموية للذيل ، وريد الضفيرة المدارية ، والوريد تحت الفك السفلي ، والقلب ، والشريان الأورطيالبطني 6 ، وما إلى ذلك. من بينها ، جمع الدم من الوريد الذيلي للفئران هو طريقة مستخدمة بشكل متكرر ، والتي تتطلب مشغلين ذوي خبرة ومهارة 7,8. لجمع الدم من الوريد الضفيرة المدارية الرجعية أقل تعقيدا. ومع ذلك ، لا ينصح بهذه الطريقة لأنها قد تلحق الضرر ببصر الفئران9 ، والدم من القلب والشريان الأورطي البطني مناسب فقط لأخذ عينات الدم النهائية10. هناك طريقة أخرى لجمع الدم من الوريد تحت الفك السفلي في الفئران الواعية التي أدت إلى المزيد من المضاعفات وكشفت عن عدم كفاية جودة عينة الدم11. لذلك ، قد يقوم الباحثون بتخدير الحيوان لتقليل صعوبة أخذ العينات. ومع ذلك ، فإن التخدير يزيد أيضا من تكلفة التجربة ، والأخطر من ذلك ، أنه سيؤثر على الحالة الأيضية للفئران12. يستخدم البروتوكول الحالي طريقة سريعة ومباشرة لجمع الدم في الأوردة تحت الترقوة للفئران دون تخدير ، مما يسمح بتحديد المواقع بدقة وجمع الدم بالتناوب الثنائي للحصول على عينات عالية الجودة في الوقت المناسب وبطريقة متكررة.
Protocol
Representative Results
Discussion
هناك فوائد معينة لجمع الدم من الأوردة تحت الترقوة. (1) نظرا لأن موقع جمع الدم ينفصل بسهولة ، والضفيرة الوريدية ليست منتظمة بسبب المواقف المختلفة للفئران ، يمكن للطريقة الموصوفة بسهولة تحديد موضع الضفيرة الوريدية مع الحفاظ على المواقف المستقرة والمريحة للفئران. (2) العملية سهلة ومواتية للتط…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
تم تمويل هذا البحث من قبل مختبر مقاطعة قوانغدونغ الرئيسي للتقييم والبحوث غير السريرية للأدوية (رقم 2018B030323024) والبرنامج الرئيسي “إنشاء دواء جديد” لخطة البحث والتطوير الرئيسية في قوانغدونغ (رقم 2019B020202001) ، مشروع أبحاث مؤسسة قوانغتشو الأساسية والتطبيقية (رقم 202002030249 ورقم 202002030156).
Materials
| 1.0 mL syringe (with needle, 26 G, 0.45 mm x 15.5 mm) | Jiangxi Hongda Medical Equipment Group LTD.(Nanchang, Jiangxi Province, China) | 20210629 | |
| 75% alcohol | Shandong Lierkang Medical Technology Co., Ltd. (Dezhou, Shandong Province, China) | 210717 | |
| Animal source | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. | grade: SPF | laboratory animal production license number: SCXK (Hunan) 2019-0004, laboratory animal quality certificate number: 4307272101972847 |
| Cotton swab | Caoxian Hualu Sanitary Materials Co., Ltd.(Heze, Shandong Province, China) | 20210301 | Need to be sterilized. |
| Electric shaver | Shenzhen Codos Electric Appliance Co. , Ltd.(Shenzhen, Guangdong Province, China) | CP-6800 | |
| EP tube, 1.5 mL | Genetimes ExCell Technology,Inc.(Shanghai, China) | ||
| Heparin sodium (2 mL:12500 IU) | Tianjin biochem pharmaceutical Co.,Ltd(Tianjing, China) | 51200702 | Prepare 1250 IU/mL heparin sodium solution. Add heparin sodium solution into the EP tube in advance and make it evenly distributed on the wall of the EP tube, and dry it at 60°C for use. |
| Labtip (volume range 5-200 μL) | Thermo Fisher Scientific Oy | 94300120 | |
| Low speed refrigerated centrifuge | Hunan Xiangyi Laboratory Instrument Development Co., Ltd.(Changsha, Hunan Province, China) | L535R | |
| Pipette gun (20-200 μL) | BRAND | 12N92305 | |
| Rats (SD) | Hunan SJA Laboratory Animal Co., Ltd. (Changsha, Hunan Province, China) | ||
| Sharp tool container | Taizhou Huangyan Yikang Plastic Factory (Taizhou, Zhejiang Province, China) | ||
| Eye drop | This reagent is not a commodity and the manufacturer requires it to be tested. In the principle of confidentiality, the manufacturer and model cannot be provided. |
References
- Shravya, K., et al. International conference on harmonization of technical requirements for registration of pharmaceuticals for human use. ICH M2 EWG. Electronic common technical document. , (2014).
- Tan, Y., et al. . The China Food and Drug Administration (CFDA). , (2015).
- McGuill, M. W., Andrew, N. R. Biological effects of blood loss: Implications for sampling volumes and techniques. ILAR Journal. 31 (4), 5-20 (1989).
- Aguilar-Mariscal, H., et al. Oral pharmacokinetics of meloxicam in the rat using a high-performance liquid chromatography method in micro-whole-blood samples. Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology. 29 (9), 587-592 (2007).
- Korfmacher, W., et al. Utility of capillary microsampling for rat pharmacokinetic studies: Comparison of tail-vein bleed to jugular vein cannula sampling. Journal of Pharmacological and Toxicological Methods. 76, 7-14 (2015).
- JoVE. JoVE Science Education Database. Blood Withdrawal I. JoVE. , (2021).
- Yang, H., et al. Subclavian vein puncture as an alternative method of blood sample collection in rats. Journal of Visualized Experiments. (141), e58499 (2018).
- Zou, W., et al. Repeated blood collection from tail vein of non-anesthetized rats with a vacuum blood collection system. Journal of Visualized Experiments. (130), e55852 (2017).
- Parasuraman, S., Raveendran, R., Kesavan, R. Blood sample collection in small laboratory animals. Journal of Pharmacology & Pharmacotherapeutics. 1 (2), 87-93 (2010).
- Itziar, F., Arantza, P., Nahia, D., Virginia, P., Juan, R. Clinical biochemistry parameters in C57BL/6J mice after blood collection from the submandibular vein and retroorbital plexus. Journal of the American Association for Laboratory Animal Science. 49 (2), 202-206 (2010).
- Heimann, M., Roth, D. R., Ledieu, D., Pfister, R., Classen, W. Sublingual and submandibular blood collection in mice: A comparison of effects on body weight, food consumption and tissue damage. Laboratory Animals. 44 (4), 352-358 (2010).
- Wren-Dail, M. A., et al. Effect of isoflurane anesthesia on circadian metabolism and physiology in rats. Comparative Medicine. 67 (2), 138-146 (2017).
- National Institute of Health. . Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. 8th edition. , (2011).
- Lee, G., Goosens, K. A. Sampling blood from the lateral tail vein of the rat. Journal of Visualized Experiments. (99), e52766 (2015).
- Diehl, K., et al. A good practice guide to the administration of substances and removal of blood, including routes and volumes. Journal of Applied Toxicology. 21 (1), 15-23 (2001).
- Casal, D., et al. Functional and physiological methods of evaluating median nerve regeneration in the rat. Journal of Visualized Experiments. (158), e59767 (2020).
