मिट्टी जनित सूक्ष्मजीवों के साथ पौधे की जड़ों को संक्रमित करने के लिए इनोक्यूलेशन रणनीतियाँ
Summary
यह प्रोटोकॉल मिट्टी-जनित रोगाणुओं के साथ पौधे की जड़ों को टीका लगाने के लिए रणनीतियों का एक विस्तृत सारांश प्रस्तुत करता है। कवक Verticillium longisporum और Verticillium dahliae के लिए उदाहरण, तीन अलग-अलग जड़ संक्रमण प्रणालियों का वर्णन किया गया है। संभावित अनुप्रयोगों और संभावित डाउनस्ट्रीम विश्लेषणों पर प्रकाश डाला गया है, और प्रत्येक प्रणाली के लिए फायदे या नुकसान पर चर्चा की जाती है।
Abstract
राइजोस्फीयर एक अत्यधिक जटिल माइक्रोबियल समुदाय को आश्रय देता है जिसमें पौधों की जड़ों को लगातार चुनौती दी जाती है। जड़ें विभिन्न प्रकार के सूक्ष्मजीवों के साथ निकट संपर्क में हैं, लेकिन मिट्टी से उत्पन्न इंटरैक्शन पर अध्ययन अभी भी जमीन के ऊपर के अंगों पर किए गए लोगों के पीछे हैं। यद्यपि मॉडल रूट रोगजनकों के साथ मॉडल पौधों को संक्रमित करने के लिए कुछ टीकाकरण रणनीतियों को साहित्य में वर्णित किया गया है, लेकिन एक व्यापक पद्धतिगत अवलोकन प्राप्त करना मुश्किल बना हुआ है। इस समस्या को हल करने के लिए, तीन अलग-अलग रूट इनोक्यूलेशन सिस्टम को सटीक रूप से वर्णित किया गया है जिसे रूट-माइक्रोब इंटरैक्शन के जीव विज्ञान में अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए लागू किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, वर्टिसिलियम प्रजातियों (अर्थात्, वी. लॉन्गिस्पोरम और वी. डहलिया) को रूट इनवाइडिंग मॉडल रोगजनकों के रूप में नियोजित किया गया था। हालांकि, विधियों को आसानी से अन्य जड़ उपनिवेशीकरण रोगाणुओं के लिए अनुकूलित किया जा सकता है – रोगजनक और लाभकारी दोनों। पौधे के जाइलम का उपनिवेशीकरण करके, संवहनी मिट्टी जनित कवक जैसे कि वर्टीसिलियम एसपीपी एक अद्वितीय जीवन शैली प्रदर्शित करते हैं। जड़ आक्रमण के बाद, वे जाइलम जहाजों के माध्यम से फैलते हैं, शूट तक पहुंचते हैं, और बीमारी के लक्षणों को प्राप्त करते हैं। तीन प्रतिनिधि पौधों की प्रजातियों को मॉडल मेजबान के रूप में चुना गया था: Arabidopsis thaliana, आर्थिक रूप से महत्वपूर्ण तिलहन बलात्कार (ब्रासिका नेपस), और टमाटर (सोलनम लाइकोपर्सिकम)। चरण-दर-चरण प्रोटोकॉल दिए गए हैं। रोगजनकता assays के प्रतिनिधि परिणाम, मार्कर जीन के transcriptional विश्लेषण, और रिपोर्टर निर्माणों द्वारा स्वतंत्र पुष्टिकरण दिखाए गए हैं। इसके अलावा, प्रत्येक टीकाकरण प्रणाली के फायदे और नुकसान पर पूरी तरह से चर्चा की जाती है। ये सिद्ध प्रोटोकॉल रूट-माइक्रोब इंटरैक्शन पर अनुसंधान प्रश्नों के लिए दृष्टिकोण प्रदान करने में सहायता कर सकते हैं। यह जानना कि पौधे मिट्टी में रोगाणुओं का सामना कैसे करते हैं, कृषि में सुधार के लिए नई रणनीतियों को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण है।
Introduction
प्राकृतिक मिट्टी में रोगाणुओं की एक आश्चर्यजनक संख्या का निवास होता हैजो पौधों के लिए तटस्थ, हानिकारक या फायदेमंद हो सकता है। कई पौधे रोगजनक मिट्टी से उत्पन्न होते हैं, जड़ों को घेरते हैं, और भूमिगत अंग पर हमला करते हैं। ये सूक्ष्मजीव क्लैड की एक विस्तृत विविधता से संबंधित हैं: कवक, ऊमिसेट्स, बैक्टीरिया, नेमाटोड, कीड़े, और कुछ वायरस 1,2। एक बार पर्यावरणीय स्थितियां संक्रमण के पक्ष में होने के बाद, अतिसंवेदनशील पौधे रोगग्रस्त हो जाएंगे और फसल की पैदावार में गिरावट आएगी। जलवायु परिवर्तन के प्रभाव, जैसे कि ग्लोबल वार्मिंग और मौसम की चरम सीमाएं, मिट्टी-जनितपौधों के रोगजनकों के अनुपात में वृद्धि करेंगी। इसलिए, इन विनाशकारी रोगाणुओं और भोजन और फ़ीड उत्पादन पर उनके प्रभाव का अध्ययन करना अधिक से अधिक महत्वपूर्ण हो जाएगा, लेकिन प्राकृतिक पारिस्थितिक तंत्र पर भी। इसके अतिरिक्त, मिट्टी में माइक्रोबियल पारस्परिकतावादी हैं जो जड़ों के साथ कसकर बातचीत करते हैं और पौधे के विकास, विकास और प्रतिरक्षा को बढ़ावा देते हैं। जब रोगजनकों का सामना करना पड़ता है, तो पौधे सक्रिय रूप से राइजोस्फीयर में विशिष्ट विरोधियों की भर्ती कर सकते हैं जो रोगजनकोंको 4,5,6,7 को दबाकर मेजबान अस्तित्व का समर्थन कर सकते हैं। हालांकि, लाभकारी रूट-माइक्रोब इंटरैक्शन में शामिल यांत्रिक विवरण और मार्ग अक्सर अभी भी अज्ञात हैं।
इसलिए, रूट-माइक्रोब इंटरैक्शन की सामान्य समझ का विस्तार करना आवश्यक है। मिट्टी जनित सूक्ष्मजीवों के साथ जड़ों को टीका लगाने के लिए विश्वसनीय तरीके मॉडल अध्ययन करने और निष्कर्षों को कृषि अनुप्रयोगों में स्थानांतरित करने के लिए आवश्यक हैं। मिट्टी में लाभकारी इंटरैक्शन का अध्ययन किया जाता है, उदाहरण के लिए, सेरेन्डिपिटा इंडिका (जिसे पहले पिरिफॉर्मोस्पोरा इंडिका के रूप में जाना जाता था), नाइट्रोजन-फिक्सिंग राइजोबियम एसपीपी, या माइकोराइजल कवक के साथ, जबकि ज्ञात मिट्टी-जनित पौधों के रोगजनकों में राल्स्टोनिया सोलानेसेरम, फाइटोफ्थोरा एसपीपी, फुसेरियम एसपीपी और वर्टिलियम एसपीपी.1 शामिल हैं। बाद के दो फंगल जेनेरा हैं जो विश्व स्तर पर वितरित किए जाते हैं और संवहनी रोगों का कारण बनतेहैं 2। Verticillium spp. (Ascomycota) पौधों की प्रजातियों के सैकड़ों को संक्रमित कर सकते हैं – काफी हद तक dicotyledons, जड़ी बूटी वार्षिक, वुडी बारहमासी, और कई फसल पौधों 2,8 सहित। Verticillium के Hyphae जड़ में प्रवेश करते हैं और जाइलम वाहिकाओं 2,9 उपनिवेश करने के लिए केंद्रीय सिलेंडर की ओर अंतरकोशिकीय और intracellularly दोनों बढ़ते हैं। इन जहाजों में, कवक अपने अधिकांश जीवन चक्र के लिए रहता है। चूंकि जाइलम का रस पोषक तत्व-गरीब है और पौधे की रक्षा यौगिकों को वहन करता है, कवक को इस अद्वितीय वातावरण के अनुकूल होना चाहिए। यह उपनिवेशीकरण से संबंधित प्रोटीन के स्राव द्वारा पूरा किया जाता है जो रोगज़नक़ को अपने मेजबान10,11 में जीवित रहने में सक्षम बनाता है। जड़ वास्कुलचर तक पहुंचने के बाद, कवक जाइलम वाहिकाओं के भीतर पत्ते तक फैल सकता है, जो मेजबान 9,12 के प्रणालीगत उपनिवेशीकरण की ओर जाता है। इस बिंदु पर, पौधे 9,10,13 की वृद्धि में नकारात्मक रूप से प्रभावित होता है। उदाहरण के लिए, स्टंटिंग और पीले पत्ते होते हैं और साथ ही समय से पहले सेनेसेंस 13,14,15,16 होते हैं।
इस जीनस का एक सदस्य वर्टीसिलियम लॉन्गिस्पोरम है, जो अत्यधिक ब्रासिकेशियस मेजबानों के लिए अनुकूलित है, जैसे कि कृषि संबंधी रूप से महत्वपूर्ण तिलहन बलात्कार, फूलगोभी, और मॉडल संयंत्र Arabidopsis thaliana12। कई अध्ययनों ने मिट्टी से उत्पन्न संवहनी रोगों और परिणामस्वरूप जड़ रक्षा प्रतिक्रियाओं 13,15,16,17 में व्यापक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए वी. लॉन्गिस्पोरम और ए. थैलियाना को संयुक्त किया। सीधे संवेदनशीलता परीक्षण को वी. लॉन्गिस्पोरम / ए थैलियाना मॉडल सिस्टम का उपयोग करके महसूस किया जा सकता है और दोनों जीवों के लिए अच्छी तरह से स्थापित आनुवंशिक संसाधन उपलब्ध हैं। V. longisporum से निकटता से संबंधित रोगज़नक़ Verticillium dahliae है। यद्यपि दोनों कवक प्रजातियां एक समान संवहनी जीवन शैली और आक्रमण प्रक्रिया का प्रदर्शन करती हैं, जड़ों से पत्तियों तक उनकी प्रसार दक्षता और ए थालियाना में रोग के लक्षण अलग-अलग होते हैं: जबकि वी. लॉन्गिस्पोरम आमतौर पर शुरुआती सेनेसेंस को प्रेरित करता है, वी। हाल ही में, एक methodological सारांश V. longisporum या V. dahliae के साथ A. thaliana को संक्रमित करने के लिए विभिन्न रूट इनोक्यूलेशन रणनीतियों को प्रस्तुत किया, प्रयोगात्मक setups19 की योजना बनाने में सहायता। क्षेत्र में, वी लॉन्गिस्पोरम कभी-कभी तिलहन बलात्कार उत्पादन12 में महत्वपूर्ण क्षति का कारण बनता है, जबकि वी डहलिया में एक बहुत ही व्यापक मेजबान रेंज होती है जिसमें कई खेती की गई प्रजातियां शामिल होती हैं, जैसे कि अंगूर, आलू और टमाटर8। यह दोनों रोगजनकों को अध्ययन करने के लिए आर्थिक रूप से दिलचस्प मॉडल बनाता है।
इस प्रकार, निम्नलिखित प्रोटोकॉल रूट इनोक्यूलेशन के लिए संभावित दृष्टिकोणों का उदाहरण देने के लिए मॉडल रूट रोगजनकों के रूप में वी . लॉन्गिस्पोरम और वी. डहलिया दोनों का उपयोग करते हैं। Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), तिलहन बलात्कार (Brasica napus), और टमाटर (सोलनम लाइकोपर्सिकम) को मॉडल होस्ट के रूप में चुना गया था। तरीकों का विस्तृत विवरण नीचे दिए गए पाठ और साथ के वीडियो में पाया जा सकता है। प्रत्येक टीकाकरण प्रणाली के लिए फायदे और नुकसान पर चर्चा की जाती है। एक साथ लिया गया, यह प्रोटोकॉल संग्रह रूट-माइक्रोब इंटरैक्शन के संदर्भ में विशिष्ट शोध प्रश्नों के लिए एक उपयुक्त विधि की पहचान करने में मदद कर सकता है।
Protocol
Representative Results
Discussion
मिट्टी जनित फाइटोपैथोजेन1 के कारण होने वाले जबरदस्त उपज नुकसान के कारण, खेती की रणनीतियों या फसल की किस्मों में सुधार की आवश्यकता है। मिट्टी जनित रोगों के रोगजनन में सीमित अंतर्दृष्टि अधिक प?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
लेखकों ने इन तरीकों पर पिछले काम के लिए टिम इवेन और जैकलीन कोमोरेक को स्वीकार किया, वोल्फगैंग ड्रोज-लेजर (फार्मास्युटिकल बायोलॉजी विभाग, वुर्जबर्ग विश्वविद्यालय, जर्मनी) के समूह को इस काम के लिए आवश्यक उपकरण और संसाधन प्रदान करने के लिए, और वोल्फगैंग ड्रोगे-लेजर के साथ-साथ फिलिप क्रेइज़ (दोनों विश्वविद्यालय वुर्जबर्ग) पांडुलिपि के महत्वपूर्ण प्रूफरीडिंग के लिए। इस अध्ययन को “ड्यूश Forschungsgemeinschaft” (DFG, DR273/15-1,2) द्वारा समर्थित किया गया था।
Materials
| Agar (Gelrite) | Carl Roth | Nr. 0039 | all systems described require Gelrite |
| Arabidopsis thaliana wild-type | NASC stock | Col-0 (N1092) | |
| Autoclave | Systec | VE-100 | |
| BlattFlaeche | Datinf GmbH | BlattFlaeche | software to determine leaf areas |
| Brassica napus wild-type | see Floerl et al., 2008 | rapid-cycling rape | genome ACaacc |
| Cefotaxime sodium | Duchefa | C0111 | |
| Chicanery flask 500 mL | Duran Group / neoLab | E-1090 | Erlenmeyer flask with four baffles |
| Collection tubes 50 mL | Sarstedt | 62.547.254 | 114 x 28 mm |
| Czapek Dextrose Broth medium | Duchefa | C1714 | |
| Digital camera | Nikon | D3100 18-55 VR | |
| Exsiccator (Desiccator ) | Duran Group | 200 DN, 5.8 L | Seal with lid to hold chlorine gas |
| Fluorescence Microscope | Leica | Leica TCS SP5 II | |
| HCl | Carl Roth | P074.3 | |
| KNO3 | Carl Roth | P021.1 | ≥ 99 % |
| KOH | Carl Roth | 6751 | |
| Leukopor | BSN medical GmbH | 2454-00 AP | non-woven tape 2.5 cm x 9.2 m |
| MES (2-(N-morpholino)ethanesulfonic acid) | Carl Roth | 4256.2 | Pufferan ≥ 99 % |
| MgSO4 | Carl Roth | T888.1 | Magnesiumsulfate-Heptahydrate |
| Murashige & Skoog medium (MS) | Duchefa | M0222 | MS including vitamins |
| NaClO | Carl Roth | 9062.1 | |
| Percival growth chambers | CLF Plant Climatics GmbH | AR-66L2 | |
| Petri-dishes | Sarstedt | 82.1473.001 | size ØxH: 92 × 16 mm |
| Plastic cups (500 mL, transparent) | Pro-pac, salad boxx | 5070 | size: 108 × 81 × 102 mm |
| Pleated cellulose filter | Hartenstein | FF12 | particle retention level 8–12 μm |
| poly klima growth chamber | poly klima GmbH | PK 520 WLED | |
| Potato Dextrose Broth medium | SIGMA Aldrich | P6685 | for microbiology |
| Pots | Pöppelmann GmbH | TO 7 D or TO 9,5 D | Ø 7 cm resp. Ø 9.5 cm |
| PromMYB51::YFP | see Poncini et al., 2017 | MYB51 reporter line | YFP (i.e. 3xmVenus with NLS) |
| Reaction tubes 2 mL | Sarstedt | 72.695.400 | PCR Performance tested |
| Rotary (orbital) shaker | Edmund Bühler | SM 30 C control | |
| Sand (bird sand) | Pet Bistro, Müller Holding | 786157 | |
| Soil | Einheitserde spezial | SP Pikier (SP ED 63 P) | |
| Solanum lycopersicum wild-type | see Chavarro-Carrero et al., 2021 | Type: Moneymaker | |
| Thoma cell counting chamber | Marienfeld | 642710 | depth 0.020 mm; 0.0025 mm2 |
| Ultrapure water (Milli-Q purified water) | MERK | IQ 7003/7005 | water obtained after purification |
| Verticillium dahliae | see Reusche et al., 2014 | isolate JR2 | |
| Verticillium longisporum | Zeise and von Tiedemann, 2002 | strain Vl43 |
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