DNA 섬유 분석을 이용한 인간 세포에서의 복제 후 갭 축적 및 복구 검출
Summary
여기서 우리는 병변 유도 후 DNA를 복제하는 데있어 단일 가닥 DNA 갭을 조사하기 위해 DNA 섬유 분석의 두 가지 변형을 설명합니다. S1 섬유 분석은 ssDNA 특이적 S1 엔도뉴클레아제를 사용하여 복제 후 갭을 검출할 수 있게 하며, 갭 채우기 분석은 갭 복구의 시각화 및 정량화를 가능하게 합니다.
Abstract
DNA 섬유 분석은 인간 세포에서 DNA 합성 중에 혼입되는 뉴클레오티드 유사체의 면역검출에 기초한 복제 포크 역학의 분석을 위한 간단하고 강력한 방법이다. 그러나이 기술은 수천 킬로베이스의 제한된 해상도를 가지고 있습니다. 결과적으로, 수백 염기만큼 작은 복제 후 단일 가닥 DNA (ssDNA) 갭은 표준 검정에 의해 검출 가능하지 않다. 여기에서는 ssDNA를 특이적으로 절단하는 효소인 S1 뉴클레아제를 활용하는 DNA 섬유 분석의 변형된 버전을 설명한다. 복제 후 ssDNA 갭이 있는 경우, S1 뉴클레아제는 틈새를 표적으로 하고 절단하여 진행 중인 포크에서 ssDNA 갭에 대한 판독으로 사용할 수 있는 더 짧은 영역을 생성합니다. 이러한 복제 후 ssDNA 갭은 손상된 DNA가 불연속적으로 복제될 때 형성된다. 그들은 게놈 복제와 결합되지 않은 메커니즘을 통해 갭 채우기 또는 복제 후 수리로 알려진 과정에서 복구 할 수 있습니다. 갭 채우기 메커니즘은 S 단계와 무관하게 DNA 합성을 포함하기 때문에 DNA 섬유 라벨링 체계의 변경은 또한 갭 채우기 이벤트를 모니터링하기 위해 사용될 수 있습니다. 전체적으로, DNA 섬유 분석의 이러한 변형은 복제 후 갭이 인간 세포의 게놈에서 어떻게 형성되고 채워지는지를 이해하는 강력한 전략입니다.
Introduction
정액 연구는 박테리아1 및 인간 세포 2,3에서 DNA 손상제를 사용한 처리시 복제 후 단일 가닥 (ssDNA) 갭의 축적에 대한 증거를 제공했다. 손상된 DNA 주형의 복제 동안, DNA 합성 기계는 특정 트랜스플레션 합성 DNA 폴리머라제를 사용하거나 주형 스위칭 메커니즘을 통해 병변을 우회할 수 있다. 대안적으로, 리플리솜은 또한 단순히 ssDNA 갭을 남겨두고 병변을 건너 뛰고, 나중에 수리될 수 있다. 보다 최근에, 한 연구는 유전 독성 제제를 사용한 치료가 복제 중간체의 특정 구조를 시각화하기 위해 전자 현미경을 활용하여 진핵생물에서 ssDNA 갭을 유도한다는 것을 분명히 보여주었습니다4. 복제 후 갭의 이들 영역의 형성은 처음에 DNA 복제2의 반불연속 모드의 간단한 결과라고 제안되었다. 이 경우, 뒤쳐진 가닥의 병변은 오카자키 단편의 신장을 차단할 수 있지만, 포크 진행은 ssDNA 갭을 남기고 다음 오카자키 단편에 의해 자연적으로 구출됩니다. 그러나 추가 연구에 따르면 박테리아 5에서 처음 나타난 것처럼 선행 가닥에 틈새 형성이 가능하다는 것이입증되었습니다. 진핵생물에서, 프리미아제 활성을 갖는 독특한 DNA 중합효소인 PRIMPOL은 그의 재검 활성 6,7,8,9,10,11을 통해 병변을 차단하는 복제 하류의 DNA 합성을 재개할 수 있는 것으로 나타났다. 따라서, PRIMPOL 프리마제 활성은 인간 세포(12)에서 DNA 손상제로 처리시 선행 가닥에서 복제 후 ssDNA 갭의 형성을 설명할 수 있다. 그럼에도 불구하고, 이러한 갭의 검출 및 갭 복구는 최근까지 전자 현미경(4) 또는 플라스미드-기반 분석(13)과 같은 간접적 또는 시간-소모적인 접근법을 필요로 하였다. 인간 세포의 틈새를 검출하기 위해 ssDNA 특이적 S1 뉴클레아제의 사용은 수크로오스 구배 기술 2,3을 사용하여 사십 년 전 초기 연구에 의해 개척되었습니다. 보다 최근에, 우리 그룹은 DNA 섬유 및 혜성 분석14와 같은 다른 방법을 사용하여 DNA를 복제 (사후 복제 갭)에서 ssDNA를 검출하기 위해이 뉴클레아제의 사용을 적용했습니다. 이러한 새로운 접근법은 복제 후 격차에 대한 연구의 현재 급증을위한 길을 열었습니다. 여기에서는 S1 뉴클레아제를 사용하여 DNA 섬유 분석법에 의해 복제 후 ssDNA 갭을 탐지하는 전략을 설명하고 DNA 섬유 프로토콜의 차등 표지 체계가 어떻게 이러한 갭의 복구에 대한 연구를 허용 할 수 있는지 설명합니다.
DNA 섬유 분석은 점점 더 많은 실험실에서 사용되어 왔으며 복제 포크 역학 및 복제 스트레스 반응 메커니즘에 대한 귀중한 통찰력을 제공하는 강력한 기술입니다. 간략하게, 이 기술은 복제 DNA에 뉴클레오티드 유사체 (예를 들어 CldU-5-클로로-2′-데옥시우리딘-및 IdU-5-요오도-2′-데옥시우리딘)의 순차적 혼입에 기초한다. 수확 후, 세포는 용해되고, DNA 분자는 양성으로 코팅된 유리 슬라이드 상에 퍼진다. CldU 및 IdU는 이어서 특이적 항체에 의해 검출되며, 이는 이색 섬유로서 형광 현미경으로 가시화될 수 있다. 마지막으로, IdU 및 CldU 관로의 길이는 DNA 손상 유도의 결과로서 DNA 복제 역학의 임의의 변화를 확인하기 위해 측정된다. 이 기술은 포크 스톨링, 포크 슬레이트, 초기 DNA 분해 및 원산지 발사 빈도15,16의 변화와 같은 다양한 현상을 조사하는 데 사용될 수 있습니다.
DNA 섬유 분석의 한 가지 한계는 몇 킬로염기의 분해능입니다. 복제 후 ssDNA 갭은 수백 염기의 범위에있을 수 있기 때문에 표준 DNA 섬유 프로토콜에 의해 이러한 갭을 직접 시각화하는 것은 불가능합니다. 유전 독성 물질로 처리 된 인간 세포에서 DNA를 복제하는 것에 대한 ssDNA 갭의 존재는 이전에 간접적으로 연루되었습니다. 예를 들어, ssDNA 결합 단백질, 복제 단백질 A(RPA)의 모집에 의해 평가된 바와 같이, S 단계 밖의 세포에서, 또는 DNA 섬유 분석법에 의한 장기간의 포크 스톨링의 부재와 결합된 알칼리성 DNA 풀림에 의해 검출된 ssDNA의 형성 12,17,18,19,20,21 ssDNA 갭의 축적에 기인하였다. 또한, 복제 후 ssDNA 갭은 ATR 의존성 G2/M 위상 체크포인트를 유도하고 복제 독극물18,19,20,21,22로 처리된 세포를 정지시킨다.
S1 뉴클레아제는 5′-포스포릴 모노- 또는 올리고뉴클레오티드를 방출하는 단일 가닥 핵산을 분해하고, RNA에 비해 ssDNA에 대해 5배 더 높은 친화도를 갖는다. 이중 가닥 핵산 (DNA:DNA, DNA:RNA 또는 RNA:RNA)은 매우 높은 농도로 사용되는 경우를 제외하고는 S1 뉴클레아제에 내성이 있습니다. S1 뉴클레아제는 또한 닉, 갭, 미스매치 또는 루프로 인해 발생하는 단일 가닥 영역에서 이중 가닥 DNA를 절단합니다. 따라서 S1 뉴클레아제는 ssDNA 갭을 절단할 수 있는 ssDNA 특이적 엔도뉴클레아제이며, 궁극적으로 이중 가닥 파단23,24를 생성한다. 따라서, DNA 섬유 프로토콜에 S1 뉴클레아제 소화를 위한 단계를 간접적으로 추가함으로써 복제 후 ssDNA 갭의 검출을 가능하게 한다. 갭의 존재하에서, DNA 확산 전에 S1 핵으로 노출된 핵을 처리하면 갭(14)에 본질적으로 존재하는 ssDNA의 S1 절단의 결과로서 더 짧은 관로가 생성될 것이다. 따라서, 트랙트 단축은 이러한 접근법을 사용하는 ssDNA 갭에 대한 판독이다. 표준 DNA 섬유 프로토콜과 비교할 때, S1 뉴클레아제를 가진 DNA 섬유는 핵 노출 (세포 투과화)과 S1 뉴클레아제 치료의 두 가지 추가 단계 만 있으면됩니다. 유전독성제로 처리되었지만 S1 뉴클레아제가 없는 샘플 및 유전독성제가 없는 S1 뉴클레아제로 처리된 샘플과 같이 적절한 조절이 필수적이라는 점에 유의하는 것이 중요하다. 유사체의 혼입, S1 처리 및 확산을 포함한 프로토콜 자체는 1 일 내에 수행 될 수 있으며 예외적 인 물질을 필요로하지 않습니다. 티미딘 유사체, 정제된 S1 뉴클레아제, 적절한 1차 및 2차 항체, 및 형광 현미경만이 필요하다. 전반적으로, S1 뉴클레아제를 채용하는 DNA 섬유는 비교적 간단한 접근법을 사용하여 진행중인 복제 포크에서 ssDNA 갭을 검출한다.
복제 스트레스 반응 메카니즘의 결과로서 형성된 복제 후 ssDNA 갭은 갭 필링 또는 복제 후 복구(PRR)25라고 불리는 프로세스에서 트랜스플레션 DNA 합성 또는 주형 스위칭을 포함한 상이한 메카니즘에 의해 복구(또는 채워짐)될 수 있다. 이러한 과정은 복제 독립적 인 DNA 합성14,26,27을 포함하는 전진하는 포크 뒤에서 발생합니다. 이러한 발견에 기초하여, 표준 DNA 섬유 분석과 구별되는 라벨링 스킴을 수행하여 G2 단계의 갭 채우기 이벤트를 직접 시각화 할 수 있습니다 14,16,26,28. 구체적으로, 하나의 티미딘 유사체는 유전 독성 처리 및 복제 후 ssDNA 갭 형성시에 복제 포크를 라벨링하는 데 사용될 수 있고, 다른 티미딘 유사체는 갭 채우기 이벤트를 라벨링하는데 사용될 수 있다. 이 프로토콜에서, 세포는 1시간 동안 유전독성 처리 직후 또는 이와 동시에 제1 티미딘 유사체 (예를 들어, IdU)로 표지되어, 초기 DNA가 갭 형성시에 표지된다. Nocodazole은 G2 / M에서 세포를 체포하기 위해 12-24 시간 동안 치료시 첨가되어 다음 S 단계를 예방합니다. 노코다졸 처리의 마지막 4시간 동안, 두 번째 티미딘 유사체(예를 들어, CldU)가 갭 충전 동안 혼입될 배지에 첨가된다. 중요하게도, 이 분석은 CldU로부터의 갭 채우기 신호가 S 단계에서 복제 DNA로의 CldU 혼입으로 인한 신호와 구별될 수 없기 때문에 G2에서 갭 채우기 이벤트를 검출하는 데에만 사용될 수 있다. 따라서, 배경 신호를 최소화하기 위해, 손상 유도 후 CldU 혼입의 타이밍은 대부분의 세포 집단이 G2 단계14에 진입할 때와 일치해야 한다. 따라서, 이러한 타이밍은 세포주 및 치료 조건에 따라 달라질 것이다. 이 검정을 채택하기 전에 세포 주기 진행을 최적화하는 것이 좋습니다. 이들 티미딘 유사체의 공동-염색은 ssDNA 갭이 생성되었을 때 유전독성 처리 동안 합성된 초기 DNA(IdU tracts)의 상부에 갭 필링(PRR) 관(CldU 패치)의 시각화를 가능하게 한다.
Protocol
Representative Results
Discussion
표준 DNA 섬유 분석 프로토콜의 중요한 단계는 이전 간행물32에서 논의되었다. 여기에서, 우리는14에서 초기에 기술된 갭 채우기에 의한 그들의 복구뿐만 아니라 복제 후 ssDNA 갭의 존재를 조사하기 위해 표준 DNA 섬유 분석의 변형된 버전을 기술한다. 복제 후 ssDNA 갭 존재의 맥락에서, S1 섬유 프로토콜에서 S1 뉴클레아제를 사용하는 것은 갭 형성 및 후속 검출을 ?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
C.F.M.M. 실험실에서의 연구는 FAPESP와 네덜란드 과학 연구기구 (NWO, 네덜란드)의 국제 협력 연구에 따라 Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP, 상파울루, 브라질, 보조금 #2019/19435-3, #2013/08028-1 및 2017/05680-0)의 지원을 받습니다. Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq, Brasília, DF, Brazil, Grants # 308868/2018-8] 및 Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal do Ensino Superior (CAPES, Brasília, DF, Brazil, Finance Code 001).
Materials
| Acetic acid, Glacial | Synth | 64-19-7 | Alternatively, BSA – Biosera – REF PM-T1725/100 |
| Ammonium hydroxide | Synth | 1336-21-6 | Or similar |
| Antibody anti-mouse IgG1 Alexa Fluor 594 | Invitrogen | A11005 | – |
| Antibody anti-rat Alexa Fluor 488 | Invitrogen | A21470 | – |
| Antibody Mouse anti-BrdU | Becton Disckson | 347580 | – |
| Antibody Rat anti-BrdU | Abcam | Ab6326 | – |
| Biological security hood | Pachane | PA 410 | Use hood present in the laboratory |
| BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A3294 | Or similar |
| Cell scraper | Thermo Scientific | 179693 | Or similar |
| CldU | Millipore-Sigma | C6891 | – |
| Cloridric acid | Synth | 7647-01-0 | Or similar |
| Confocal Zeiss LSM Series (7, 8 or 9) | Zeiss | – | Or similar |
| Cover glass (or coverslips) | Thermo Scientific | 152460 | Alternatively, Olen – Kasvi Cover Glass (24 x 60 mm) – K5-2460 |
| DMEM – High Glucose | LGC/Gibco | BR30211-05/12100046 | Use culture media specific for the cell line used. |
| EDTA (Ethylenediaminetetraacetic acid disodium salt dihydrate) | Sigma-Aldrich | E5314 | Or similar |
| Epifluorescence Microscope Axiovert 200 | Zeiss | – | Or similar |
| FBS (Fetal Bovine Serum) | Gibco | 12657-029 | Or similar |
| Forma Series II Water Jacketed CO2 Incubator | Thermo Scientific 3110 | 13-998-074 | Use cell incubator present in the laboratory |
| Glass slide jar | Sigma-Aldrich | S5516 | Or similar |
| Glycerol | Sigma-Aldrich | 56-81-5 | Or similar |
| Idu | Millipore-Sigma | I7125 | – |
| Magnesium Chloride | Synth | 7791-18-6 | Or similar |
| Methanol | Merck | 67-56-1 | Or similar |
| Microscope slides | Denville | M1021 | Alternatively, Olen – Kasvi Microscope Slides – K5-7105 OR Precision Glass Line – 7105-1 |
| MOPS (Ácido 3-morfolinopropano 1-sulfônico) | Synth | 1132-61-2 | Or similar |
| Nocodazole | Sigma-Aldrich | 31430-18-9 | – |
| PBS (Phosphate Buffer Saline) | Life Thechnologies | 3002 | Or similar |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140122 | Or similar |
| ProLong Gold AntiFade Mountant | Invitrogen | P36930 | Any antifade moutant solution for immunofluorescence could be used |
| S1 nuclease purified from Aspergillus oryzae | Invitrogen | 18001-016 | Pre-dilute the S1 nuclease (1/100 – 1/200) in S1 nuclease dilution buffer provided by the manufacturer, aliquote and store at -20 °C |
| SDS (Sodium Dodecyl Sulfate) | BioRad | 161-0302 | Or similar |
| Sodium Acetate Trihydrate | Sigma-Aldrich | 6131-90-4 | Or similar |
| Sodium Chloride | Synth | 7647-14-5 | Or similar |
| Sucrose | Sigma-Aldrich | 57-50-1 | Or similar |
| Tris Base | West Lab Research | BP152-1 | Or similar |
| Triton X-100 | Synth | 9002-93-1 | Or similar |
| Trypsin | Gibco | 25200072 | Or similar |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P1379 | Or similar |
| UVC Lamp | Non Specific | – | Essential: emission lenght of 254 nm |
| VLX-3W UV Radiometer | Vilber Loumart | – | Or similar |
| Zinc Acetate | Sigma-Aldrich | 557-34-6 | Or similar |
References
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