이온 이동성 분광법 (IMS)은 생체 분자의 특성화를위한 질량 분광법에 대한 흥미로운 보완물이며, 특히 이성체에 민감하기 때문입니다. 이 프로토콜은 분자의 분리 및 그 단편의 이동성 프로파일의 생성을 허용하는 탠덤 IMS (IMS/IMS) 실험을 설명합니다.
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이 논문에서
요약
초록
화학 구조의 정확한 특성화는 근본적인 생물학적 메커니즘과 기능적 특성을 이해하는 데 중요합니다. 질량 분광법 (MS)은 인기있는 도구이지만 모든 구조적 특징을 완전히 드러내기에 항상 충분하지는 않습니다. 예를 들어, 탄수화물은 생물학적으로 관련이 있지만, 그 특성화는 수많은 수준의 이성체에 의해 복잡합니다. 이온 이동성 분광법 (IMS)은 이온 입체 형태에 민감하고 따라서 이성체에 민감하기 때문에 흥미로운 보완물입니다.
또한, 최근 발전으로 기술이 크게 향상되었습니다: 마지막 세대의 순환 IMS 계측기는 향상된 분해능 또는 탠덤 이온 이동성(IMS/IMS) 실험을 수행할 수 있는 가능성과 같은 선형 IMS 계측기에 비해 추가 기능을 제공합니다. IMS/IMS 동안, 이온은 이온 이동성에 기초하여 선택되고, 단편화되고, 그 단편에 대한 이온 이동성 정보를 얻기 위해 재분석된다. 최근의 연구에 따르면 이러한 IMS / IMS 데이터에 포함 된 단편의 이동성 프로파일은 특정 글리 칸의 지문으로 작용할 수 있으며 구조적으로 관련된 방식으로 글리코믹 데이터 세트를 구성하기위한 분자 네트워킹 전략에 사용될 수 있습니다.
따라서 이 프로토콜의 목표는 샘플 준비부터 재현 가능한 스펙트럼을 산출하는 이온 이동성 차원의 최종 CCS(충돌 횡단면) 교정에 이르기까지 IMS/IMS 데이터를 생성하는 방법을 설명하는 것입니다. 하나의 대표적인 글리칸의 예를 들자면, 이 프로토콜은 순환 IMS 장비에 IMS/IMS 제어 시퀀스를 구축하는 방법, IMS 도달 시간을 드리프트 시간(즉, 이온에 적용된 효과적인 분리 시간)으로 변환하기 위해 이 제어 시퀀스를 설명하는 방법, 그리고 원시 데이터로부터 관련 이동성 정보를 추출하는 방법을 보여줄 것이다. 이 프로토콜은 IMS/IMS 실험의 중요 사항을 명확하게 설명하도록 설계되었으므로 새로운 순환 IMS 사용자가 간단하고 재현 가능한 인수를 수행할 수 있도록 도와줍니다.
서론
생체 분자의 완전한 화학적 특성화는 근본적인 생물학적 및 기능적 특성을 이해하는 열쇠입니다. 이를 위해 "omics"과학은 최근 몇 년 동안 생물학적 농도에서 화학 구조의 대규모 특성화를 목표로 발전했습니다. 프로테오믹스 및 대사체학에서 MS는 생물학적 매질에서 발견되는 구조적 이질성을 푸는 핵심 도구가되었으며, 특히 탠덤 MS (MS / MS)를 통해 구조 정보를 제공 할 수있는 감도와 능력 덕분입니다. MS / MS 전략에서 이온은 질량에 따라 선택된 다음 단편화되고 마지막으로 분자의 지문을 확립하기 위해 단편의 질량을 획득합니다. MS/MS 스펙트럼은, 특히, 스펙트럼 데이터베이스1,2와 일치시키거나, 부모 구조들3,4를 잠정적으로 재구성하는데 사용될 수 있다. 유사한 스펙트럼이 유사한 화합물에 속한다는 가정 하에서, MS/MS 데이터는 유사성 점수5,6을 통해 관련 종을 연결하는 분자 네트워크(MN)를 구축하는데 사용될 수도 있다.
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프로토콜
참고: 프로토콜에 대한 개요는 그림 1에 나와 있습니다. 본 프로토콜에 기재된 실험에 사용된 파라미터는 보충 표 S1 및 보충 표 S2에서 찾을 수 있다.
1. 시료용액의 제조
참고: 프로토콜은 아라비녹실란 펜타사카라이드(23-α-L-아라비노푸라노실-크실로테트라오스 또는 XA2XX; 표 참조)를 예로 들어 설명한다.
- 용매의 제조: 50:50 H2O:MeOH 중의 500 μM LiCl (vol./vol.).
- 212 mg의 LiCl을 칭량하여 H2O 중의 100 mM 염화리튬(LiCl) 원액을 제조하고, 50 mL의 폴리프로필렌 코니컬 튜브에 50 mL의 고순도 탈이온수(H2O)를 첨가한다. 완전히 녹을 때까지 흔들어 주십시오.
참고: 용매는 분광계의 이온 소스에서 [M+Li]+ 부가물의 형성을 촉진하기 위해 리튬 염으로 도핑되며, 이는 일반적으로 다른 알칼리 부가물에 비....
- 212 mg의 LiCl을 칭량하여 H2O 중의 100 mM 염화리튬(LiCl) 원액을 제조하고, 50 mL의 폴리프로필렌 코니컬 튜브에 50 mL의 고순도 탈이온수(H2O)를 첨가한다. 완전히 녹을 때까지 흔들어 주십시오.
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결과
아라비녹실란 오타당류인 XA2XX가 이 프로토콜을 설명하기 위한 예로 선택되었다. 이 화합물은 상업적으로 입수가능하지만, 단지 다른 아라비녹실란 펜타사카라이드 XA3XX(순수한 XA3XX도 상업적으로 입수가능함)와의 혼합물로서만 입수가능하다. XA2XX 및 XA3XX의 구조는 보충 그림 S1에 나와 있습니다. 상용 혼합물 중의 XA2XX와 XA3XX의 비율이 ∼50:50이므로, 혼합물의 20 μg/mL에서의 용액을 50:50 MeOH/H2O + 500 μM LiCl에서 ~10 μg/mL의 XA2XX 농도에 도달하도록 제조하였다.
먼저, XA2XX+XA3XX 혼합물의 MS 분석을 고해상도 MS를 사용하여 수행하였다. 두 화합물이 이성질체이.......
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토론
SELECT SERIES 순환 IMS는 업스트림 크로마토그래피 분리 없이 정의된 이온 집단(주어진 m/z 및 이온 이동성)을 선택할 수 있는 강력한 도구입니다. 이 계측기는 MS/MS 및 IMS/IMS 스펙트럼을 모두 추출할 수 있는 이 이온 집단의 이차원 단편화 맵을 생성할 수 있는 가능성을 제공합니다. 그러나 사용자는 실험 프로세스 중에주의가 필요한 몇 가지 중요한 점에 유의해야합니다.
먼저, 사용자는 MS 격리 창에서 가능한 등압 오염물의 존재에 대해 주의 깊게 점검해야 한다. 실제로, 사중극자의 격리 창은 비교적 넓으며, 사중극자에서 공선택될 수 있는 약간 다른 m/z 의 이온을 아는 것은 사용자가 이온 이동성에 대한 관심의 피크를 적절하게 할당하는 데 도움이 될 것이다.
둘째, 초기 분리를 수행할 때, 사용자는 모든 이온이 순환 이온 이동성 셀 주위에서 동일한 수의 통과를 겪도록 보장해야 .......
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공개 사항
저자는 공개 할 이해 상충이 없습니다.
감사의 글
S.O.는 그의 박사 학위 (보조금 ANR-18-CE29-0006)에 자금을 지원 한 프랑스 국립 연구소에 감사드립니다.
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재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 33-α-L- plus 23-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX/XA2XX) 혼합물 | Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland | O-XAXXMIX | XA2XX + XA3XX 혼합물 |
| 33-α-L-Arabinofuranosyl-xylotetraose (XA3XX) | Megazyme Ltd., Wicklow, Ireland | O-XA3XX | Pure XA3XX standard |
| Eppendorf Safe-Lock Tubes, 1.5 mL, Eppendorf Quality, 무색, 1,000 튜브 | Eppendorf, 함부르크, 독일 | 0030120086 | 탄수화물 원액 및 희석 |
| FALCON 50 mL 폴리프로필렌 코니컬 튜브 30 x 115 mm | Corning Science Mé를 준비하는 데 사용됩니다. xico S.A. de C.V., Reynosa, Tamaulipas, Mexico | 352070 | 100 mM LiCl |
| 리튬 클로라이드 (ACS 시약, ≥ 99 %) | Sigma-Aldrich Inc., Saint Quentin Fallavier, France | 310468 | 리튬으로 시료를 도핑하는 데 사용됨 |
| Mix IMS/Tof Calibration Kit | Waters Corp., Wilmslow, UK | 186008113 | MS 및 IMS |
| MassLynx 4.2 SCN1016 Release 6용 검량 솔루션(Cyclic IMS 2.9.1 Release 9용 Waters 임베디드 분석기 플랫폼) | Waters Corp., Wilmslow, UK | 721022377 | 기기 제어 및 데이터 처리를 위한 Cyclic IMS 공급업체 소프트웨어 |
| HPLC PLUS 그래디언트 등급 | Carlo-Erba 시약용 메탄올, Val de Reuil, 프랑스 | 412383 | 고순도 용매 |
| MS Leucine Enkephaline Kit | Waters Corp., Wilmslow, UK | 700002456 | 질량 |
| SCHOTT DURAN 100 mL 붕규산 유리병 | VWR INTERNATIONAL, Radnor, Pennsylvania, US | 218012458 | 500 µ의 용액을 준비하는 데 사용됩니다. M LiCl in 50:50 MeOH/Water |
| SELECT SERIES Cyclic IMS | Waters Corp., Wilmslow, UK | 186009432 | cylic IMS 셀이 장착된 이온 이동성 질량 분석기 |
| 웹사이트: http://mzmine.github.io/ | MZmine 개발 팀 | - | MZmine 소프트웨어 다운로드 링크 |
| 웹사이트: https://github.com/siollivier/IM-MN | INRAE, UR BIA, BIBS 시설, 낭트, 프랑스 | - | CCS 보정 기능이 포함된 사내 R 스크립트에 대한 링크 |
참고문헌
- Allard, P. -M., et al. Integration of molecular networking and in-silico MS/MS fragmentation for natural products dereplication. Analytical Chemistry. 88 (6), 3317-3323 (2016).
- Wang, M., et al. Mass spectrometry searches using MASST. <....
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재인쇄 및 허가
