JoVE Journal > Environment
Summary
Abstract
Introduction
Protocol
Results
Discussion
Disclosures
Acknowledgements
Materials
References
자동 번역
환경과학

Bioprospektering af ekstremofile mikroorganismer til bekæmpelse af miljøforurening

Published: December 30, 2021
doi:
10.3791/63453
, , , , ,
1Department of Biology,University of Naples Federico II, 2Institute of Polymers, Composites and Biomaterials (IPCB),Consiglio Nazionale delle Ricerche CNR, 3Division of Biological Systems and Engineering,Lawrence Berkeley National Laboratory, 4BAT Center-Interuniversity Center for Studies on Bioinspired Agro-Environmental Technology,University of Napoli Federico II

Summary

Isolering af tungmetalresistente mikrober fra geotermiske kilder er et varmt emne for udviklingen af bioremediering og miljøovervågningsbiosystemer. Denne undersøgelse giver en metodologisk tilgang til isolering og identifikation af tungmetaltolerante bakterier fra varme kilder.

Abstract

Geotermiske kilder er rige på forskellige metalioner på grund af samspillet mellem sten og vand, der finder sted i det dybe akvifer. På grund af sæsonvariation i pH og temperatur observeres der desuden periodisk udsving i elementsammensætningen inden for disse ekstreme miljøer, hvilket påvirker de miljømæssige mikrobielle samfund. Ekstremofile mikroorganismer, der trives i vulkanske termiske ventilationskanaler, har udviklet resistensmekanismer til at håndtere flere metalioner, der er til stede i miljøet, og dermed deltage i komplekse metalbiogeokemiske cyklusser. Desuden har ekstremofiler og deres produkter fundet et omfattende fodfæste på markedet, og det gælder især for deres enzymer. I denne sammenhæng er deres karakterisering funktionel for udviklingen af biosystemer og bioprocesser til miljøovervågning og bioremediering. Hidtil udgør isolering og dyrkning under laboratorieforhold af ekstremofile mikroorganismer stadig en flaskehals for fuldt ud at udnytte deres bioteknologiske potentiale. Dette arbejde beskriver en strømlinet protokol for isolering af termofile mikroorganismer fra varme kilder samt deres genotypiske og fænotypiske identifikation gennem følgende trin: (1) Prøveudtagning af mikroorganismer fra geotermiske steder (“Pisciarelli”, et vulkansk område i Campi Flegrei i Napoli, Italien); 2) Isolering af tungmetalresistente mikroorganismer 3) Identifikation af mikrobielle isolater (4) Fænotypisk karakterisering af isolaterne. De metoder, der er beskrevet i dette arbejde, kan generelt også anvendes til isolering af mikroorganismer fra andre ekstreme miljøer.

Introduction

De ekstreme miljøer på vores planet er fremragende kilder til mikroorganismer, der er i stand til at tolerere barske forhold (dvs. temperatur, pH, saltholdighed, tryk og tungmetaller)1,2, idet de er Island, Italien, USA, New Zealand, Japan, Centralafrika og Indien, de bedst anerkendte og studerede vulkanske områder 3,4,5,6,7,8,9 . Termofiler har udviklet sig i barske miljøer i en række temperaturer fra 45 ° C til 80 ° C 10,11,12. Termofile mikroorganismer, der enten tilhører de arkæale eller bakterielle kongeriger, er et reservoir til undersøgelse af biodiversitet, fylogenese og produktion af eksklusive biomolekyler til industrielle anvendelser 13,14,15,16. Faktisk har den fortsatte industrielle efterspørgsel på det globale marked i de sidste årtier tilskyndet til udnyttelse af ekstremofiler og termozymer til deres diversificerede anvendelser inden for flere bioteknologiske områder 17,18,19.

Varme kilder, hvor organismer lever i konsortier, er rige kilder til biodiversitet og repræsenterer således et attraktivt levested for at studere mikrobiel økologi20,21. Desuden koloniseres disse vulkanske metalrige områder almindeligvis af mikroorganismer, der har udviklet tolerancesystemer til at overleve og tilpasse sig tilstedeværelsen af tungmetaller22,23 og er derfor aktivt involveret i deres biogeokemiske cyklusser. I dag betragtes tungmetaller som prioriterede forurenende stoffer for mennesker og miljø. De tungmetalresistente mikroorganismer er i stand til at opløse og udfælde metaller ved at omdanne dem og ombygge deres økosystemer24,25. Forståelsen af de molekylære mekanismer for tungmetalresistens er et varmt emne for det presserende behov for at udvikle nye grønne tilgange 26,27,28. I den forbindelse udgør opdagelsen af nye tolerante bakterier udgangspunktet for at udvikle nye strategier for miljømæssig bioremediering24,29. Som led i bestræbelserne på at udforske hydrotermiske miljøer gennem mikrobiologiske procedurer og øge kendskabet til den rolle, som genet/generne, der understøtter tungmetaltolerancen, spiller, blev der foretaget en mikrobiel screening i det varme kildeområde Campi Flegrei i Italien. Dette tungmetalrige miljø viser en kraftig hydrotermisk aktivitet, fumarol og kogende puljer, variabel i pH og temperatur i afhængighed af sæsonbestemthed, nedbør og underjordiske geologiske bevægelser30. I dette perspektiv beskriver vi en let anvendelig og effektiv måde at isolere bakterier, der er resistente over for tungmetaller, for eksempel Geobacillus stearothermophilus GF1631 (navngivet som isolat 1) og Alicyclobacillus mali FL1832 (navngivet som isolat 2) fra Pisciarelli-området i Campi Flegrei.

Protocol

1. Prøveudtagning af mikroorganismer fra geotermiske steder Vælg stedet for prøveudtagning ved hjælp af som kriterium steder med ønsket temperatur og pH. Mål de fysiske parametre gennem en digital termoelementsonde, indsæt den i de valgte puljer eller mudder. Saml 20 g jordprøver (i dette tilfælde fra mudder i det hydrotermiske sted Pisciarelli Solfatara), og saml dem op med en steriliseret ske. Tag mindst to prøver for hvert valgt sted. Kom prøverne i 50 ml steri…

Representative Results

PrøveudtagningsstedDenne protokol illustrerer en metode til isolering af tungmetalresistente bakterier fra en varm kilde. I denne undersøgelse blev Pisciarelli-området, et syre-sulfidisk geotermisk miljø, anvendt som prøveudtagningssted (figur 1). Dette økosystem er kendetegnet ved strømmen af aggressive svovlholdige væsker afledt af vulkanske aktiviteter. Det er blevet påvist, at de mikrobielle samfund i syre-sulfidiske geotermiske systemer uds…

Discussion

Varme kilder indeholder en uudnyttet mangfoldighed af mikrobiomer med lige så forskellige metaboliske kapaciteter12. Udviklingen af strategier for isolering af mikroorganismer, der effektivt kan omdanne tungmetaller til mindre giftige forbindelser10 , repræsenterer et forskningsområde af stigende interesse på verdensplan. Dette papir har til formål at beskrive en strømlinet tilgang til screening og isolering af mikrober med evnen til at modstå giftige kemikalier. Den…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Dette arbejde blev støttet af ERA-NET Cofund MarTERA: “FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing”, PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 og af GoodbyWaste: ObtainGOOD products-exploit BY-products-reduce WASTE, MIUR 2017-JTNK78.006, Italien. Vi takker Dr. Monica Piochi og Dr. Angela Mormone (Istituto Nazionale di Geofisica e Vulcanologia, Sezione di Napoli Osservatorio Vesuviano, Italien) for identifikation og karakterisering af geotermisk sted.

Materials

Ampicillin Sigma Aldrich A9393
Aura Mini bio air s.c.r.l. Biological hood
Bacitracin Sigma Aldrich B0125
Cadmium chloride Sigma Aldrich 202908
Chloramphenicol Sigma Aldrich C0378
Ciprofloxacin Sigma Aldrich 17850
Cobalt chloride Sigma Aldrich C8661
Copper chloride Sigma Aldrich 224332
Erythromycin Sigma Aldrich E5389
Exernal Service DSMZ Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH
Genomic DNA Purification Kit Thermo Scientific #K0721
Kanamycin sulphate Sigma Aldrich 60615
MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE4000
Mercury chloride Sigma Aldrich 215465
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Scientific
Nickel chloride Sigma Aldrich 654507
Orion Star A221 Portable pH Meter Thermo Scientific STARA2218
Sodium (meta) arsenite Sigma Aldrich S7400
Sodium arsenate dibasic heptahydrate Sigma Aldrich A6756
Sodium chloride Sigma Aldrich S5886
Streptomycin Sigma Aldrich S6501
Tetracycline Sigma Aldrich 87128
Tryptone BioChemica Applichem Panreac A1553
Vancomycin Sigma Aldrich PHR1732
Yeast extract for molecular biology Applichem Panreac  A3732
DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Arora, N. K., Panosyan, H. Extremophiles: applications and roles in environmental sustainability. Environmental Sustainability. 2, 217-218 (2019).
  2. Gallo, G., Puopolo, R., Carbonaro, M., Maresca, E., Fiorentino, G. Extremophiles, a nifty tool to face environmental pollution: From exploitation of metabolism to genome engineering. International Journal of Environmental Research and Public Health. 18 (10), 5228 (2021).
  3. Saxena, R., et al. Metagenomic analysis of hot springs in Central India reveals hydrocarbon degrading thermophiles and pathways essential for survival in extreme environments. Frontiers in Microbiology. 7, 2123 (2017).
  4. Papke, R. T., Ramsing, N. B., Bateson, M. M., Ward, D. M. Geographical isolation in hot spring cyanobacteria. Environmental Microbiology. 5 (8), 650-659 (2003).
  5. Zitelle, L., Lan Pe, N. I. al The role of photosynthesis and CO2 evasion in travertine formation: a quantitative investigation at an important travertine-depositing hot spring. Journal of the Geological Society. 164, 843-853 (2007).
  6. Kubo, K., Knittel, K., Amann, R., Fukui, M., Matsuura, K. Sulfur-metabolizing bacterial populations in microbial mats of the Nakabusa hot spring. Japan. Systematic and Applied Microbiology. 34 (4), 293-302 (2011).
  7. Siljeström, S., Li, X., Brinckerhoff, W., van Amerom, F., Cady, S. L. ExoMars mars organic molecule analyzer (MOMA) laser desorption/ionization mass spectrometry (LDI-MS) analysis of phototrophic communities from a silica-depositing hot spring in Yellowstone national park, USA. Astrobiology. , (2021).
  8. Aulitto, M., Tom, L. M., Ceja-Navarro, J. A., Simmons, B. A., Singer, S. W. Whole-genome sequence of Brevibacillus borstelensis SDM, isolated from a sorghum-adapted microbial community. Microbiology Resource Announcements. 9 (48), 8-9 (2020).
  9. Antranikian, G., et al. Diversity of bacteria and archaea from two shallow marine hydrothermal vents from Vulcano Island. Extremophiles. 21 (4), 733-742 (2017).
  10. Gallo, G., Puopolo, R., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Metal-tolerant thermophiles: from the analysis of resistance mechanisms to their biotechnological exploitation. The Open Biochemistry Journal. 12 (1), 149-160 (2018).
  11. Aulitto, M., et al. Draft genome sequence of Bacillus coagulans MA-13, a thermophilic lactic acid producer from lignocellulose. Microbiology Resource Announcements. 8 (23), 341-360 (2019).
  12. Mehta, D., Satyanarayana, T. Diversity of hot environments and thermophilic microbes. Thermophilic Microbes in Environmental and Industrial Biotechnology: Biotechnology of Thermophiles. , (2013).
  13. Fusco, S., et al. The interaction between the F55 virus-encoded transcription regulator and the RadA host recombinase reveals a common strategy in Archaea and Bacteria to sense the UV-induced damage to the host DNA. Biochimica et Biophysica Acta – Gene Regulatory Mechanisms. 1863 (5), (2020).
  14. Puopolo, R., et al. Self-assembling thermostable chimeras as new platform for arsenic biosensing. Scientific Reports. 11 (1), (2021).
  15. Fiorentino, G., Contursi, P., Gallo, G., Bartolucci, S., Limauro, D. A peroxiredoxin of Thermus thermophilus HB27: Biochemical characterization of a new player in the antioxidant defence. International Journal of Biological Macromolecules. 153, 608-615 (2020).
  16. Fiorentino, G., Del Giudice, I., Bartolucci, S., Durante, L., Martino, L., Del Vecchio, P. Identification and physicochemical characterization of BldR2 from Sulfolobus solfataricus, a novel archaeal member of the MarR transcription factor family. 생화학. 50 (31), 6607-6621 (2011).
  17. Bhattacharya, A., Gupta, A. G. . Microbial Extremozymes. Current trends in applicability of thermophiles and thermozymes in bioremediation of environmental pollutants. , 161-176 (2022).
  18. Aulitto, M., et al. Prebiotic properties of Bacillus coagulans MA-13: Production of galactoside hydrolyzing enzymes and characterization of the transglycosylation properties of a GH42 β-galactosidase. Microbial Cell Factories. 20 (1), 1-18 (2021).
  19. Ing, N., et al. A multiplexed nanostructure-initiator mass spectrometry (NIMS) assay for simultaneously detecting glycosyl hydrolase and lignin modifying enzyme activities. Scientific Reports. 11 (1), 11803 (2021).
  20. Saw, J. H. W. Characterizing the uncultivated microbial minority: towards understanding the roles of the rare biosphere in microbial communities. mSystems. 6 (4), 0077321 (2021).
  21. He, Q., et al. Temperature and microbial interactions drive the deterministic assembly processes in sediments of hot springs. Science of the Total Environment. 772, 145465 (2021).
  22. Shakhatreh, M. A. K., et al. Microbiological analysis, antimicrobial activity, and heavy-metals content of Jordanian Ma’in hot-springs water. Journal of Infection and Public Health. 10 (6), 789-793 (2017).
  23. Antonucci, I., et al. An ArsR/SmtB family member regulates arsenic resistance genes unusually arranged in Thermus thermophilus HB27. Microbial Biotechnology. 10 (6), 1690-1701 (2017).
  24. Ozdemir, S., Kılınç, E., Poli, A., Nicolaus, B. Biosorption of Heavy Metals (Cd 2+, Cu 2+ , Co 2+ , and Mn 2+ ) by Thermophilic Bacteria, Geobacillus thermantarcticus and Anoxybacillus amylolyticus Equilibrium and Kinetic Studies. Bioremediation Journal. 17 (2), 86-96 (2013).
  25. Hlihor, R. -. M., Apostol, L. -. C., Gavrilescu, M. Environmental bioremediation by biosorption and bioaccumulation: Principles and applications. Enhancing Cleanup of Environmental Pollutants: Volume 1: Biological Approaches. , 289-315 (2017).
  26. Del Giudice, I., Limauro, D., Pedone, E., Bartolucci, S., Fiorentino, G. A novel arsenate reductase from the bacterium Thermus thermophilus HB27: its role in arsenic detoxification. Biochimica et Biophysica Acta (BBA)-Proteins and Proteomics. 1834 (10), 2071-2079 (2013).
  27. Politi, J., Spadavecchia, J., Fiorentino, G., Antonucci, I., Casale, S., De Stefano, L. Interaction of Thermus thermophilus ArsC enzyme and gold nanoparticles naked-eye assays speciation between As(III) and As(V). Nanotechnology. 26 (43), 435703 (2015).
  28. Antonucci, I., et al. Characterization of a promiscuous cadmium and arsenic resistance mechanism in Thermus thermophilus HB27 and potential application of a novel bioreporter system. Microbial Cell Factories. 17 (1), (2018).
  29. Ilyas, S., Lee, J. C., Kim, B. S. Bioremoval of heavy metals from recycling industry electronic waste by a consortium of moderate thermophiles: Process development and optimization. Journal of Cleaner Production. 70, 194-202 (2014).
  30. Piochi, M., Mormone, A., Strauss, H., Balassone, G. The acid-sulfate zone and the mineral alteration styles of the Roman Puteolis (Neapolitan area, Italy): clues on fluid fracturing progression at the Campi Flegrei volcano. Solid Earth. 10 (6), 1809-1831 (2019).
  31. Puopolo, R., et al. Identification of a new heavy-metal-resistant strain of Geobacillus stearothermophilus isolated from a hydrothermally active volcanic area in southern Italy. International Journal of Environmental Research and Public Health. 17 (8), 2678 (2020).
  32. Aulitto, M., et al. Genomic insight of Alicyclobacillus mali FL18 isolated from an Arsenic-rich hot spring. Frontiers in Microbiology. 12, 639697 (2021).
  33. Agarwala, R., et al. Database resources of the National Center for Biotechnology Information. Nucleic Acids Research. 46, 8-13 (2018).
  34. Altschul, S. F., et al. Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs. Nucleic Acids Research. 25 (17), 3389-3402 (1997).
  35. Sievers, F., Higgins, D. G. Clustal Omega. Current Protocols in Bioinformatics. 2014, 1-16 (2014).
  36. Kliem, M., Sauer, S. The essence on mass spectrometry based microbial diagnostics. Current Opinion in Microbiology. 15 (3), 397-402 (2012).
  37. Madeira, F., et al. The EMBL-EBI search and sequence analysis tools APIs in 2019. Nucleic Acids Research. 47, 636-641 (2019).
  38. Piochi, M., Mormone, A., Balassone, G., Strauss, H., Troise, C., De Natale, G. Native sulfur, sulfates and sulfides from the active Campi Flegrei volcano (southern Italy): Genetic environments and degassing dynamics revealed by. Journal of Volcanology and Geothermal Research. 301, 180-193 (2015).
  39. Hsu, H. -. C., et al. Assessment of temporal effects of a mud volcanic eruption on the bacterial community and their predicted metabolic functions in the mud volcanic sites of Niaosong, Southern Taiwan. Nicroorganisms. 9 (11), 2315 (2021).
  40. Ye, J., Rensing, C., Su, J., Zhu, Y. G. From chemical mixtures to antibiotic resistance. Journal of Environmental Sciences (China). 62, 138-144 (2017).
  41. Farias, P., et al. Natural hot spots for gain of multiple resistances: arsenic and antibiotic resistances in heterotrophic, aerobic bacteria from marine hydrothermal vent fields. Applied and Environmental Microbiology. 81 (7), 2534-2543 (2015).
  42. Aulitto, M., Fusco, S., Nickel, D. B., Bartolucci, S., Contursi, P., Franzén, C. J. Seed culture pre-adaptation of Bacillus coagulans MA-13 improves lactic acid production in simultaneous saccharification and fermentation. Biotechnology for Biofuels. 12 (1), 45 (2019).

Tags

Keywords: BioprospectingExtremophilic MicroorganismsEnvironmental PollutionHeavy Metal ResistanceBiosensingBioremediationGeothermal SpringsLuria-Bertani MediumPHTemperatureGrowth ProfileBacterial Lysis Buffer
check_url/kr/63453?article_type=t

Play Video
PDF
DOI
DOWNLOAD MATERIALS LIST
Cite This Article
Gallo, G., Aulitto, M., Contursi, P., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Bioprospecting of Extremophilic Microorganisms to Address Environmental Pollution. J. Vis. Exp. (178), e63453, doi:10.3791/63453 (2021).
Download Citation
Reprints and Permissions

View Video

✖

To prove you're not a robot, please enter the text in the image below

CAPTCHA Image
Play CAPTCHA Audio
Refresh Image