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환경과학

Bioprospecção de microrganismos extreílicos para enfrentar a poluição ambiental

Published: December 30, 2021
doi:
10.3791/63453
, , , , ,
1Department of Biology,University of Naples Federico II, 2Institute of Polymers, Composites and Biomaterials (IPCB),Consiglio Nazionale delle Ricerche CNR, 3Division of Biological Systems and Engineering,Lawrence Berkeley National Laboratory, 4BAT Center-Interuniversity Center for Studies on Bioinspired Agro-Environmental Technology,University of Napoli Federico II

Summary

O isolamento de micróbios resistentes a metais pesados de fontes geotérmicas é um tema quente para o desenvolvimento de bioremediação e monitoramento ambiental de biossistemas. Este estudo fornece uma abordagem metodológica para isolar e identificar bactérias tolerantes a metais pesados a partir de fontes termais.

Abstract

As nascentes geotérmicas são ricas em vários íons metálicos devido à interação entre rocha e água que ocorre no aquífero profundo. Além disso, devido à variação sazonalidade do pH e da temperatura, a flutuação na composição do elemento é observada periodicamente dentro desses ambientes extremos, influenciando as comunidades microbianas ambientais. Microrganismos extreílicos que prosperam em aberturas térmicas vulcânicas desenvolveram mecanismos de resistência para lidar com vários íons metálicos presentes no ambiente, participando assim de ciclos biogeoquímicos metálicos complexos. Além disso, os extremófilos e seus produtos têm encontrado uma ampla base no mercado, e isso vale especialmente para suas enzimas. Nesse contexto, sua caracterização é funcional para o desenvolvimento de biossistemas e bioprocessos para monitoramento ambiental e bioremediação. Até o momento, o isolamento e o cultivo em condições laboratoriais de microrganismos extreílicos ainda representam um gargalo para a exploração plena de seu potencial biotecnológico. Este trabalho descreve um protocolo simplificado para o isolamento de microrganismos termofílicos de fontes termais, bem como sua identificação genotípica e fenotípica através das seguintes etapas: (1) Amostragem de microrganismos de sítios geotérmicos (“Pisciarelli”, uma área vulcânica de Campi Flegrei em Nápoles, Itália); (2) Isolamento de microrganismos resistentes ao metal pesado; (3) Identificação de isolados microbianos; (4) Caracterização fenotípica dos isolados. As metodologias descritas neste trabalho podem ser geralmente aplicadas também para o isolamento de microrganismos de outros ambientes extremos.

Introduction

Os ambientes extremos do nosso planeta são excelentes fontes de microrganismos capazes de tolerar condições severas (ou seja, temperatura, pH, salinidade, pressão e metais pesados)1,2, sendo Islândia, Itália, EUA, Nova Zelândia, Japão, África Central e Índia, as áreas vulcânicas mais reconhecidas e estudadas 3,4,5,6,7,8,9 . Os termófilos evoluíram em ambientes severos em uma faixa de temperaturas de 45 °C a 80 °C 10,11,12. Os microrganismos termofílicos, pertencentes aos reinos arqueais ou bacterianos, são um reservatório para o estudo da biodiversidade, filogênese e produção de biomoléculas exclusivas para aplicações industriais 13,14,15,16. De fato, nas últimas décadas, a contínua demanda industrial no mercado global tem incentivado a exploração de extremófilos e termozymes para suas aplicações diversificadas em diversos campos biotecnológicos 17,18,19.

As fontes termais, onde os organismos vivem em consórcios, são ricas fontes de biodiversidade, representando assim um habitat atraente para estudar a ecologia microbiana20,21. Além disso, essas áreas ricas em metais vulcânicos são comumente colonizadas por microrganismos que evoluíram sistemas de tolerância para sobreviver e se adaptar à presença de metais pesados22,23 e, portanto, estão ativamente envolvidos em seus ciclos biogeoquímicos. Atualmente, metais pesados são considerados poluentes prioritários para os seres humanos e para o meio ambiente. Os microrganismos resistentes ao metal pesado são capazes de solubilizar e precipitar metais transformando-os e remodelando seus ecossistemas24,25. A compreensão dos mecanismos moleculares da resistência ao metal pesado é um tema quente para a urgência de desenvolver novas abordagens verdes 26,27,28. Nesse contexto, a descoberta de novas bactérias tolerantes representa o ponto de partida para o desenvolvimento de novas estratégias de bioremediação ambiental24,29. Ao acompanhar os esforços para explorar ambientes hidrotérmicos através de procedimentos microbiológicos e aumentar o conhecimento sobre o papel dos genes que sustentam a tolerância ao metal pesado, foi realizada uma triagem microbiana na área de primavera quente de Campi Flegrei, na Itália. Este ambiente rico em metais pesados mostra uma poderosa atividade hidrotérmica, fumarole e piscinas de ebulição, variável em pH e temperatura em dependência de sazonalidade, chuvas e movimentos geológicos subterrâneos30. Nessa perspectiva, descrevemos uma maneira fácil de aplicar e eficaz de isolar bactérias resistentes a metais pesados, por exemplo, Geobacillus stearothermophilus GF1631 (nomeado como isolado 1) e Alicyclobacillus mali FL1832 (nomeado como isolado 2) da área de Pisciarelli de Campi Flegrei.

Protocol

1. Amostragem de microrganismos de sítios geotérmicos Escolha o local para amostragem usando como critério locais com temperatura e pH desejados. Meça os parâmetros físicos através de uma sonda termopar digital, inserindo-a nas piscinas ou lamas selecionadas. Coletar 20 g de amostras de solos (neste caso, de lama no sítio hidrotérmico de Pisciarelli Solfatara), recolhendo-os com uma colher esterilizada. Pegue pelo menos duas amostras para cada local escolhido. Coloq…

Representative Results

Local de amostragemEste protocolo ilustra um método para o isolamento de bactérias resistentes a metais pesados de uma fonte termal. Neste estudo, a área de Pisciarelli, um ambiente geotérmico ácido-sulfísico, foi utilizada como local de amostragem (Figura 1). Este ecossistema é caracterizado pelo fluxo de fluidos sulfúricos agressivos derivados de atividades vulcânicas. Foi demonstrado que as comunidades microbianas em sistemas geotérmicos ác…

Discussion

As fontes termais contêm uma diversidade inexplorada de microbiomas com capacidades metabólicas igualmente diversas12. O desenvolvimento de estratégias para o isolamento de microrganismos que possam converter eficientemente metais pesados em compostos menos tóxicos10 representa uma área de pesquisa de crescente interesse em todo o mundo. Este artigo tem como objetivo descrever uma abordagem simplificada para a triagem e isolamento de micróbios com a capacidade de resi…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabalho foi apoiado pelo ERA-NET Cofund MarTERA: “FLAshMoB: Functional Amyloid Chimera for Marine Biosensing”, PRIN 2017-PANACEA CUP:E69E19000530001 e pela GoodbyWaste: Obtaingood produtos-exploram por produtos-reduzir resíduos, MIUR 2017-JTNK78.006, Itália. Agradecemos ao Dr. Monica Piochi e à Dra.

Materials

Ampicillin Sigma Aldrich A9393
Aura Mini bio air s.c.r.l. Biological hood
Bacitracin Sigma Aldrich B0125
Cadmium chloride Sigma Aldrich 202908
Chloramphenicol Sigma Aldrich C0378
Ciprofloxacin Sigma Aldrich 17850
Cobalt chloride Sigma Aldrich C8661
Copper chloride Sigma Aldrich 224332
Erythromycin Sigma Aldrich E5389
Exernal Service DSMZ Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH
Genomic DNA Purification Kit Thermo Scientific #K0721
Kanamycin sulphate Sigma Aldrich 60615
MaxQTM 4000 Benchtop Orbital Shaker Thermo Scientific SHKE4000
Mercury chloride Sigma Aldrich 215465
NanoDrop 1000 Spectrophotometer Thermo Scientific
Nickel chloride Sigma Aldrich 654507
Orion Star A221 Portable pH Meter Thermo Scientific STARA2218
Sodium (meta) arsenite Sigma Aldrich S7400
Sodium arsenate dibasic heptahydrate Sigma Aldrich A6756
Sodium chloride Sigma Aldrich S5886
Streptomycin Sigma Aldrich S6501
Tetracycline Sigma Aldrich 87128
Tryptone BioChemica Applichem Panreac A1553
Vancomycin Sigma Aldrich PHR1732
Yeast extract for molecular biology Applichem Panreac  A3732
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Keywords: BioprospectingExtremophilic MicroorganismsEnvironmental PollutionHeavy Metal ResistanceBiosensingBioremediationGeothermal SpringsLuria-Bertani MediumPHTemperatureGrowth ProfileBacterial Lysis Buffer
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Gallo, G., Aulitto, M., Contursi, P., Limauro, D., Bartolucci, S., Fiorentino, G. Bioprospecting of Extremophilic Microorganisms to Address Environmental Pollution. J. Vis. Exp. (178), e63453, doi:10.3791/63453 (2021).
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