Detta protokoll beskriver en encellsmetod för iterativa epigenomiska analyser med en återanvändbar enda cell. Den återanvändbara enda cellen möjliggör analyser av flera epigenetiska märken i samma enda cell och statistisk validering av resultaten.
Nuvarande encellsepigenomanalyser är utformade för engångsbruk. Cellen kasseras efter en enda användning, vilket förhindrar analys av flera epigenetiska märken i en enda cell och kräver data från andra celler för att skilja signal från experimentellt bakgrundsbrus i en enda cell. Denna artikel beskriver en metod för att återanvända samma enda cell för iterativa epigenomiska analyser.
I denna experimentella metod förankras cellulära proteiner först till en polyakrylamidpolymer istället för att tvärbinda dem till protein och DNA, vilket lindrar strukturell bias. Detta kritiska steg möjliggör upprepade experiment med samma enda cell. Därefter glödgas en slumpmässig primer med en ställningssekvens för närhetsligering till det genomiska DNA, och den genomiska sekvensen tillsätts till primern i förlängning med användning av ett DNA-polymeras. Därefter binds en antikropp mot en epigenetisk markör och kontroll-IgG, var och en märkt med olika DNA-sonder, till respektive mål i samma enda cell.
Närhetsligering induceras mellan den slumpmässiga primern och antikroppen genom att lägga till ett kontakt-DNA med komplementära sekvenser till ställningssekvensen för den slumpmässiga primern och antikropps-DNA-sonden. Detta tillvägagångssätt integrerar antikroppsinformation och närliggande genomsekvenser i en enda DNA-produkt av närhetsligering. Genom att möjliggöra upprepade experiment med samma enda cell möjliggör denna metod en ökning av datatätheten från en sällsynt cell och statistisk analys med endast IgG och antikroppsdata från samma cell. De återanvändbara enskilda cellerna som framställs med denna metod kan lagras i minst några månader och återanvändas senare för att bredda epigenetisk karakterisering och öka datatätheten. Denna metod ger flexibilitet till forskare och deras projekt.
Encellsteknik går in i en era av encellsmultiomik, som integrerar individuell encells-omics-teknik1. Nyligen har encellstranskriptomik kombinerats med metoder för att detektera kromatintillgänglighet (scNMT-seq2 och SHARE-seq3) eller histonmodifieringar (Paired-seq4 och Paired-Tag5). På senare tid integrerades encellstranskriptomik och proteomik med kromatintillgänglighet (DOGMA-seq6). Dessa metoder använder transposasbaserad märkning för att detektera kromatintillgänglighet eller histonmodifieringar.
Transposasbaserade metoder klyver genomiskt DNA och lägger till en DNA-streckkod i slutet av det genomiska DNA-fragmentet. Varje klyvt genomiskt fragment kan bara acceptera upp till två DNA-streckkoder (= ett epigenetiskt märke per klyvningsställe), och det genomiska DNA vid klyvningsstället går förlorat. Därför har klyvningsbaserade metoder en avvägning mellan antalet epigenetiska märken som testats och signaltätheten. Detta försvårar analysen av flera epigenetiska märken i samma enda cell. En encells epigenomisk metod som inte klyver det genomiska DNA: t utvecklades för att övervinna denna fråga 7,8.
Förutom den klyvningshärledda frågan som nämns ovan har transposasbaserade metoder andra begränsningar. I encellsepigenomanalys är det viktigt att känna till placeringen av histoner och DNA-associerade proteiner på genomet. I nuvarande tillvägagångssätt uppnås detta genom att använda ofixerade enskilda celler och retention av protein-DNA och protein-proteininteraktioner. Detta genererar emellertid stark bias till tillgängliga kromatinregioner, även vid analys av histonmodifieringar 9. Placeringen av histoner och genomassocierade proteiner på genomet kan bevaras utan tvärbindning av protein-DNA och protein-protein med hjälp av en polyakrylamidställning 7,8. Detta tillvägagångssätt minskar den strukturella bias som observerats i nuvarande tillvägagångssätt som är beroende av protein-DNA och protein-proteininteraktioner.
Transposasbaserade metoder kan bara hämta signaler en gång från en enda cell. Därför är det svårt att avgränsa det fullständiga epigenomet hos en enda cell på grund av signalernas bortfall. Återanvändbara enskilda celler har utvecklats för att övervinna nuvarande begränsningar genom att tillåta iterativ epigenomisk analys i samma enda cell.
Den här artikeln beskriver steg-för-steg-protokollet för den nyligen rapporterade encellsmultiepigenomiska analysen med återanvändbara enskilda celler7. I de följande styckena diskuterar vi kritiska punkter och betonar potentiella begränsningar i protokollet.
En av de kritiska punkterna i hela protokollet (från steg 7.2-13) är att undvika DNase-kontaminering. En enda cell har bara två kopior av genomiskt DNA. Därför minskar skadligt genomiskt DNA kritiskt s…
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Drs. David Sanchez-Martin och Christopher B. Buck för kommentarer under konceptualiseringsstadiet av projektet. Vi tackar också Genomics Core, Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health för hjälp i preliminära experiment och Collaborative Bioinformatics Resource, CCR, NCI, NIH för råd i beräkningsanalys. Vi tackar Anna Word för att hon hjälpt till med optimering av DNA-polymeraser som används i metoden. Detta arbete utnyttjade beräkningsresurserna i NIHHPC Biowulf-klustret (http://hpc.nih.gov). Detta projekt stöds av det intramurala programmet för Center for Cancer Research, National Cancer Institute, National Institutes of Health, NCI Director’s Innovation Award (# 397172) och federala medel från National Cancer Institute under kontrakt nr. HHSN261200800001E. Vi tackar Drs. Tom Misteli, Carol Thiele, Douglas R. Lowy och alla medlemmar i Laboratory of Cellular Oncology för produktiva kommentarer.
10x CutSmart buffer | New England BioLabs | B6004 | 10x Digestion buffer |
200 proof ethanol | Warner-Graham Company | 200 proof | Ethanol |
5-Hydroxymethylcytosine (5-hmC) Monoclonal Antibody [HMC/4D9] | Epigentek | A-1018-100 | Anti-5hmC |
Acridine Orange/Propidium Iodide Stain | Logos Biosystems | F23001 | Cell counter |
Acrylamide solution, 40% in H2O, for molecular biology | MilliporeSigma | 01697-500ML | 40% acrylamide solution |
All-in-One Fluorescence Microscope BZ-X710 | Keyence | BZ-X710 | Scanning microscope |
Amicon Ultra-0.5 Centrifugal Filter Unit | MilliporeSigma | UFC510024 | Ultrafiltration cassette |
Ammonium persulfate for molecular biology | MilliporeSigma | A3678-100G | Ammonium persulfate powder |
Anhydrous DMF | Vector laboratories | S-4001-005 | Anhydrous N,N-dimethylformamide (DMF) |
Anti-RNA polymerase II CTD repeat YSPTSPS (phospho S5) antibody [4H8] | Abcam | ab5408 | Anti-Pol II |
Anti-TRAP220/MED1 (phospho T1457) antibody | Abcam | ab60950 | Anti-Med1 |
BciVI | New England BioLabs | R0596L | BciVI |
Bovine Serum Albumin solution, 20 mg/mL in H2O, low bioburden, protease-free, for molecular biology | MilliporeSigma | B8667-5ML | 20% BSA (Table 7) |
Bst DNA Polymerase, Large Fragment | New England BioLabs | M0275L | Bst DNA polymerase |
BT10 Series 10 µl Barrier Tip | NEPTUNE | BT10 | P10 low-retention tip |
CellCelector | Automated Lab Solutions | N/A | Automated single cell picking robot |
CellCelector 4 nl nanowell plates for single cell cloning, Plate S200-100 100K, 24 well,ULA | Automated Lab Solutions | CC0079 | 4 nL nanowell plate |
Chloroform | MilliporeSigma | Chloroform | |
Corning Costar 96-Well, Cell Culture-Treated, Flat-Bottom Microplate | Corning | 3596 | Flat-bottom 96-well plates |
Deep Vent (exo-) DNA Polymerase | New England BioLabs | M0259L | Exo– DNA polymerase |
DNA LoBind Tubes, 0.5 mL | Eppendorf | 30108035 | 0.5 mL DNA low-binding tube |
DNA Oligo, 1st random primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 1st random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#01 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#02 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#03 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#04 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#05 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#06 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#07 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#08 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#09 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#10 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#11 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd random primer Cell#12 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd random primer |
DNA Oligo, 2nd synthesis primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | 2nd synthesis primer |
DNA Oligo, Ligation Adaptor | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Ligation Adaptor |
DNA Oligo, Reverse Transcription primer | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | Reverse Transcription primer |
DNase I (RNase-free) | New England BioLabs | M0303L | DNase I (RNase-free, 4 U). |
DNase I Reaction Buffer | New England BioLabs | B0303S | 10x DNase I buffer (NEB) |
dNTP Mix (10 mM each) | Thermo Fisher | R0192 | 10 mM dNTPs |
Fetal Bovine Serum, USA origin, Heat-inactivated | MilliporeSigma | F4135-500ML | Fetal bovine serum |
HiScribe T7 High Yield RNA Synthesis Kit | New England BioLabs | E2040S | In-vitro-transcription master mix |
Histone H3K27ac antibody | Active motif | 39133 | Anti-H3K27ac |
Histone H3K27me3 antibody | Active motif | 39155 | Anti-H3K27me3 |
IgG from rabbit serum | Millipore Sigma | I5006-10MG | Control IgG |
Iron oxide(II,III) magnetic nanopowder, 30 nm avg. part. size (TEM), NHS ester functionalized | MilliporeSigma | 747467-1G | NHS ester functionalized 30 nm iron oxide powder |
K-562 | American Type Culture Collection (ATCC) | CCL-243 | cells |
Linear Acrylamide (5 mg/mL) | Thermo Fisher | AM9520 | Linear Acrylamide |
LUNA-FL Dual Fluorescence Cell Counter | Logos Biosystems | L20001 | Cell counter |
LUNA Cell Counting Slides, 50 Slides | Logos Biosystems | L12001 | Cell counter |
Mineral oil, BioReagent, for molecular biology, light oil | MilliporeSigma | M5904-500ML | Mineral oil |
N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine for molecular biology | MilliporeSigma | T7024-100ML | N,N,N′,N′-Tetramethylethylenediamine |
NaCl (5 M), RNase-free | Thermo Fisher | AM9760G | 5M NaCl |
NanoDrop Lite | Thermo Fisher | 2516 | Microvolume spectrophotometer |
NEST 2 mL 96-Well Deep Well Plate, V Bottom | Opentrons | N/A | 2 mL deep well 96-well plate |
Non-skirted 96-well PCR plate | Genesee Scientific | 27-405 | 96-well PCR plate |
NuSive GTG Agarose | Lonza | 50081 | Agarose |
OmniPur Acrylamide: Bis-acrylamide 19:1, 40% Solution | MilliporeSigma | 1300-500ML | 40%Acrylamide/Bis-acrylamide |
OT-2 lab robot | Opentrons | OT2 | Automated liquid handling robot |
Paraformaldehyde, EM Grade, Purified, 20% Aqueous Solution | Electron Microscopy Sciences | 15713 | 20% Pararmaldehyde |
PBS (10x), pH 7.4 | Thermo Fisher | 70011044 | 10x PBS |
PIPETMAN Classic P1000 | GILSON | F123602 | A P1000 pipette |
Protein LoBind Tubes, 1.5 mL | Eppendorf | 925000090 | 1.5 mL Protein low-binding tube |
QIAgen Gel Extraction kit | Qiagen | 28706 | A P1000 pipette |
Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay | Thermo Fisher | P11495 | dsDNA specific intercalator dye |
Quick Ligation kit | New England BioLabs | M2200L | T4 DNA ligase (NEB) |
RNaseOUT Recombinant Ribonuclease Inhibitor | Thermo Fisher | 10777019 | RNAse inhibitor |
S-4FB Crosslinker (DMF-soluble) | Vector laboratories | S-1004-105 | Succinimidyl 4-formylbenzoate (S-4FB) |
S-HyNic | Vector laboratories | S-1002-105 | Succinimidyl 6-hydrazinonicotinate acetone hydrazone (S-HyNic) |
Sodium Acetate, 3 M, pH 5.2, Molecular Biology Grade | MilliporeSigma | 567422-100ML | 3M Sodium acetate (pH 5.2) |
Sodium bicarbonate, 1M buffer soln., pH 8.5 | Alfa Aesar | J60408 | 1M sodium bicarbonate buffer, pH 8.5 |
Sodium phosphate dibasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3264-250G | Na2HPO4 |
Sodium phosphate monobasic for molecular biology | MilliporeSigma | S3139-250G | NaH2PO4 |
SuperScript IV reverse transcriptase | Thermo Fisher | 18090050 | Reverse transcriptase |
SYBR Gold Nucleic Acid Gel Stain (10,000x Concentrate in DMSO) | Thermo Fisher | S11494 | An intercalator dye for DNA |
T4 DNA Ligase Reaction Buffer | New England BioLabs | B0202S | 10x T4 DNA ligase reaction buffer |
ThermoPol Reaction Buffer Pack | New England BioLabs | B9004S | 10x TPM-T buffer (Tris-HCl/Pottasium chloride/Magnesium sulfate/Triton X-100) |
TRIzol LS reagent | Thermo Fisher | 10296-028 | Guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction |
TruSeq Nano DNA library prep kit | Illumina | 20015965 | A DNA library preparation kit (see also the manufacturer's instruction) |
Ultramer DNA Oligo, Anti-5hmC_Ab#005 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27ac_Ab#002 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
Ultramer DNA Oligo, Anti-H3K27me3_Ab#003 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
Ultramer DNA Oligo, Anti-Med1_Ab#004 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
Ultramer DNA Oligo, Anti-Pol II_Ab#006 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for antibody |
Ultramer DNA Oligo, Control IgG_Ab#001 | Integrated DNA Technologies | N/A, see Table 3 | An amine-modified DNA probe for control IgG |
UltraPure 0.5 M EDTA, pH 8.0 | Thermo Fisher | 15575020 | 0.5M EDTA, pH 8.0 |
UltraPure DNase/RNase-Free Distilled Water | Thermo Fisher | 10977023 | Ultrapure water |
Zeba Splin Desalting Columns, 7K MWCO, 0.5 mL | Thermo Fisher | 89882 | Desalting column |