En metode for intraduktiv injeksjon av reagenser for en etanolbasert ablativ løsning på musens brystkanaltre for in vivo-avbildning og forebygging av brystkreft er beskrevet. Injeksjon direkte inn i brystvorteåpningen gjør det mulig å målrette pattedyr epitelceller med minimal sikkerhetsvevsskade.
Brystkreft er den mest utbredte kreftformen og den nest ledende årsaken til kreftrelatert død for kvinner i USA. For høyrisikokvinner er profylaktisk mastektomi den mest effektive primære forebyggingsstrategien. Profylaktisk mastektomi er en aggressiv kirurgisk prosedyre som helt fjerner pattedyrets epitelceller hvorfra brystkreft oppstår sammen med det omkringliggende vevet. Vi søker å utvikle en minimalt invasiv intraductal prosedyre som et alternativ til profylaktisk mastektomi for å lokalt fyre opp pattedyrets epitelceller før de kan bli ondartede. Vi og andre har utviklet en intraduktiv leveringsprosedyre for å nå og behandle disse epitelcellene i gnagermodeller av brystkreft. Mens musen brystkjertelen med en enkelt ikke-anastomosed duktør tre åpning på brystvorten har en mye mindre kompleks og tortuous arkitektur enn det menneskelige brystet, kjemisk indusert og genetisk konstruert mus modeller av brystkreft er verdifulle for å produsere proof-of-concept studier av nye forebyggende strategier. Her beskriver vi en prosedyre for intraductal levering av en etanolbasert ablativ løsning som inneholder mikro-CT / røntgen tantalbasert kontrastmiddel i musens brystkanaltre for terapeutisk formål med primær forebygging av brystkreft. Intraductal levering av vandige reagenser (f.eks. cytotoksiske forbindelser, siRNAer, AdCre) er tidligere beskrevet i musemodeller. Dermed fokuserer vi vår protokollbeskrivelse på metodologiske modifikasjoner og unike eksperimentelle hensyn for optimalisering av levering av etanol, for å minimere lokale og systemiske bivirkninger av etanoladministrasjon, og for in vivo-visualisering av kanaltrefylling via mikro-CT / fluoroskopiavbildning. Visualisering av kanaltreet umiddelbart etter injeksjon av en kontrastholdig løsning gir mulighet for bekreftelse av fullstendig fylling eller mislykkede resultater som underfylling eller overfylling. Denne prosedyren kan brukes til levering og avbildning av andre ablative forbindelser som tar sikte på enten å forhindre tumordannelse eller lokalt behandle tidlige svulster som er tilgjengelige via kanaltreet.
Brystkreft er en vanlig og potensielt dødelig sykdom med få alternativer tilgjengelig for forebygging1. Den mest effektive intervensjonen er profylaktisk mastektomi; Imidlertid velger bare høyrisikopersoner å gjennomgå denne prosedyren, da det er en operasjon med store livsendrende konsekvenser2. Prosedyren fjerner helt pattedyrets epitelceller hvorfra brystkreft oppstår sammen med det omkringliggende vevet. Dette kan føre til fysisk, psykologisk og sosialt stress for individet, og fraråder ofte enkeltpersoner å fortsette med denne kirurgiske prosedyren som deres første linje med primærintervensjon.
Vi har vist at levering av en ablativ løsning som inneholder 70% etanol (EtOH) direkte inn i kanaltreet, er effektiv til å drepe pattedyr epitelceller med begrenset sikkerhetsvevsskade og ved å forhindre brysttumorer i musemodeller3. EtOH har lenge vært brukt klinisk som et ablativt eller skleroserende middel for lokal behandling. Perkutan EtOH injeksjon brukes som et ablativt middel for unresectable leversvulster, nyre- og binyre neoplasmer, og bukspyttkjertelen cystiske svulster4,5,6; for cøliaki plexus neurolyse for å redusere smerte7; og for behandling av bryst pseudoaneurysmer8. Intravaskulær EtOH injeksjon brukes som et skleroserende middel for å eliminere hevelse og deformasjon fra arteriovenøse misdannelser (AVM), og for kosmetisk behandling av edderkopp årer og åreknuter9,10,11,12,13. Som profylaktisk mastektomi, hengsler suksessen med forebygging med lokal levering av en ablativ løsning på evnen til å fjerne alle pattedyr epitelceller som kreft potensielt kan oppstå fra. Dette krever bekreftelse på at det ablative stoffet har fylt kanaltreet, og dermed kontaktet alle pattedyr epitelceller direkte. Kliniske midler for injeksjon av stoffer i brystkjertlene og visualisering av dem ved bildestyrt fluoroskopi eller dukografi er lett tilgjengelig14,15; Derfor vil det være mulig å både levere og bekrefte vellykket levering når denne prosedyren kan garantere evaluering i kliniske studier.
Å demonstrere gjennomførbarheten av denne bildestyrte tilnærmingen hos forsøksdyr er et viktig skritt i å etablere effekt og translasjonell gjennomførbarhet av intraductal (ID) ablasjon som et forebyggende tiltak for brystkreft. I vårt laboratorium har vi utviklet en metode for å injisere alle brystkjertler i mus med en ablativ løsning som inneholder et kontrastmiddel over et kurs av ukentlige injeksjoner for å sikre at dyret ikke bukker under for en overdose av EtOH (figur 1, figur 2, referansenr.3,16). Denne prosedyren plasserer en 34 G nål inne i brystvorteåpningen til en isofluranbedøvelses-bedøvet mus for å injisere testløsningen. Noen viktige forbedringer av prosedyren inkluderer bruk av gastight sprøyter for væske og gasser, injeksjon av høyere volumer per ductal trær17, og utvidet antiinflammatorisk behandling. Den prekliniske behandlingen av 5 mg/kg carprofen, en NSAID, fra 2 d før til 7 d etter ID-prosedyren er i tråd med klinisk sklerosbehandling for AVM. Vanligvis, etter systemisk anestesi, mottar pasientene antiinflammatoriske medisiner, som NSAIDs, i 2 dager etter prosedyren som kan utvides for å redusere lokal betennelse eller smerte12. Alkoholforgiftning reduseres betydelig ved intraperitoneal injeksjon av en 5% sukroseoppløsning hos mus. Ved administrering av denne sukroseløsningen kan mus trygt injiseres med opptil 160 μL 70% EtOH (opptil fire kanaltrær; ca. 0,4 g / dl EtOH-innhold i blod); dyr fullstendig gjenopprettet innen 4 timer etter ID-injeksjoner. For injeksjon av mer enn fire kjertler hos mus og / eller høyere EtOH-konsentrasjoner, utfører vi sekvensielle økter for å gi nok gjenopprettingstid. Alkoholforgiftning hos kvinner ville være en mindre bekymring på grunn av den lavere andelen alkohol som utgjør kroppsvekten. Gitt antall kanaltrær i humant bryst14,15, ca 16, og estimert volum for å fylle hver trekanal18,19, vil opptil 32 ml av 70% EtOH administreres. Denne mengden vil være mye lavere enn 50 ml av 95% EtOH administrert i andre kliniske prosedyrer4,9. Intravenøs administrering av tiamin- og glukoseoppløsning kan brukes til ytterligere å minimere effekten av EtOH-forgiftning, spesielt i tilfeller der et større totalt volum av EtOH kanskje må injiseres og/eller for kvinner som har lavere toleranse for alkoholforbruk (f.eks. alleliske varianter i alkohol eller aldehyddehydrogenaser).
Ved å avbilde via mikro-CT/fluoroskopi kan vi bekrefte vellykket kanalfylling av hver kjertel (figur 1, figur 2, bilde 3). Dette kan registreres for fremtidig analyse, eller vurderes i øyeblikket via sanntids fluoroskopiavbildning, som det ville bli gjort i klinisk anvendelse, for å begrense den totale strålingsbyrden som pålegges dyret. For ytterligere å forbedre spesifikke funksjoner i denne ablative løsningen for sanntids bildestyrt levering in vivo, sammenlignet vi tidligere FDA-godkjent jodholdig kontrast til et tantaloksid (TaOx)-inneholdende nanopartikkel syntetisert av Shapiro lab3,16. TaOx viste overlegen ytelse som et mikro-CT kontrastmiddel for visualisering av den første fyllingen av kanaltreet (figur 2, figur 3). TaOx kan brukes som referansekontrast for å utføre en mer systematisk og langsgående vurdering av andre nanopartikkelbaserte kontrastmidler i blodpoolen (f.eks. jod-, vismut- eller gullholdig) og kompatibilitet med TaOx med forskjellige konsentrasjoner av etylcellulose som gellingmiddel20,21.
Profylaktisk mastektomi er for tiden den mest effektive intervensjonen for brystkreft, men den har noen alvorlige negative konsekvenser. Lokal ablasjon av pattedyr epitelceller med en EtOH-basert løsning er en lovende alternativ terapi som vi demonstrerte i en konseptgodkjenningsstudie om den aggressive FVB-Tg-C3(1)-TAg musemodellen av brystkreft3. ID-injeksjon av denne ablative løsningen muliggjør målretting av pattedyrets epitelceller hvorfra brystkreft oppstår med begrenset sikkerhetsskade. Tilsetning av et røntgenkontrastmiddel til den ablative løsningen gir økt forståelse av effektiviteten av løsningen ved forebygging, da vi kan se om hvert kanaltre er vellykket fylt etter injeksjon (figur 2B). Visning av injiserte kjertler ved fluoroskopi umiddelbart etter injeksjon speiler hva som sannsynligvis vil bli gjort i klinikken for å bekrefte vellykket fylling av kanaltreet. Visuell bekreftelse på løsningslevering vil best informere om alle deler av treet er nådd i sanntid. Dette kan føre til at ytterligere injeksjon kan utføres for å fullføre fyllingen på det tidspunktet eller i en fremtidig økt. Det er av stor betydning at ablativ løsning når alle deler av kanaltreet for å sikre at alle epitelceller kan nås for drap (figur 3). Å etterlate seg levende epitelceller i treet ville tillate muligheten for at brystkreft fortsatt kunne oppstå. Bruk av kontrast i ID-injeksjoner til bildesuksess av injeksjonen kan også være nyttig for andre formuleringer. Tabell 1 inneholder feilsøking og nyttige tips. Andre studier har beskrevet ID-leveringsprotokoller for viruspartikler (f.eks. AdCre, CRISPR-guide RNAer), hormoner, cytotoksiske forbindelser, siRNAer og/eller målrettingsmidler hos mus3,16,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37 ,38, rotter24,32,39,40,41, og kaniner42,43,44,45,46,47. Uavhengige kliniske studier rapporterte vellykket kannkulasjon på opptil åtte kanaler per bryst for lokal levering av kjemoterapi40,48,49. Å visualisere full fylling når du leverer andre løsninger rettet mot forebygging eller rettet mot behandling, vil være verdt av lignende grunner. Kunnskapen om at løsningen har nådd alle grener og terminalender av treet vil være informativ i vurderingen av vellykket forebygging eller behandling.
Vi er ikke klar over andre intraductal avbildningsmetoder hos mus33,34 eller andre dyremodeller47 som har råd til den høye oppløsningen av TaOx nanopartikler. Vær oppmerksom på at TaOx i murinkanaltreet overgår FDA-godkjente kontrastmidler for diagnostisk dukografi3,16. Når vi fortsetter å vurdere ID-ens ablative prosedyre for dens evne til å forebygge brystkreft, vil vi kunne bestemme nærmere nøyaktig hvilke kjertler kreft oppstår ved hjelp av tilsatte data gitt gjennom avbildning etter ID-levering. For eksempel kan man avgjøre om en kjertel som bare var delvis fylt er mer sannsynlig enn en ikke-injisert kjertel for å resultere i tumordannelse, som adresserer sikkerhetsprofilen og bekymringen for mislykkede injeksjoner på en høyrisikokvinne. Denne teknikken har noen begrensninger. Dette er en relativt utfordrende museteknikk som krever fingerferdighet og dyktighet fra operatøren for å manipulere og lykkes med å kanylere hver kanal. Hver enkelt injeksjon er en uavhengig hendelse og dermed mislykket injeksjon på en eller flere kjertler kan kompromittere resultat tolkning. Gitt størrelsen på murinpattedyrkjertelen og skjørheten i brystvorten, er fluoroskopi eller lignende bildeveiledningsteknikk ikke tilgjengelig for å informere i sanntid når infusjonen skal stoppes. Denne sanntids bildeveiledningen vil være et krav for klinisk implementering av lokal levering av en ablativ løsning.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble delvis støttet av National Cancer Institute R21 CA226579 og R01 CA258314 tilskudd til AKU og av National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering R01 EB029418 stipend til EMS. Vi vil takke MSU Institute for Quantitative (IQ) Health Science and Engineering Imaging Core for bruk av bildesystemer og teknisk ekspertise. Vi vil takke Dr. Danielle Ferguson for å ha gjennomgått innholdet i videoen og tallene for overholdelse av retningslinjer for dyrevelferd.
AnalyzeDirect v12.0 | Caliper | n/a | For micro-CT image processing |
Carprieve, Carprofen 50 mg/mL | Allivet | 50647 | For anti-inflammatory treatment |
Evans blue | Sigma | E2129-50G | For injection visualization |
Hot water bath | Toolots | Yidu_HH-S2 | For preparing carprofen cups |
Imaris | Bitplane | n/a | For confocal image processing |
MediGel Sucralose Cups | ClearH2O | 74-02-5022 | For delivery of carprofen |
Model 1705 RN Syringe, 50μL | Hamilton | 7655-01 | For intraductal injection |
Photoshop 2021 | Adobe | n/a | For image processing |
Quantum GX2 microCT Imaging System | Perkin Elmer | CLS149276 | For micro-CT image acquisition |
Small Hub RN Needle, 34 gauge, custom (12° bevel angle, 0.375 in, point style 4) | Hamilton | 207434 | For intraductal injection |
Stereo Microscope SZM Series | AmScope | SM-4TPZ-144 | For intraductal injection |
Sterile blue food dye | McCormick | 930641 | For injection visualization |
Sterile phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 14190250 | For solution preparation |
Stickers | DOT Scientific | DOTSCI-C50 | For preparing carprofen cups |
Sucrose | Calbiochem | 8550-5KG | For intraductal injection |
Syringes | Fisher | 14-826-79 | For preparing carprofen cups |
Vortex | VWR | 10153-834 | For preparing carprofen cups |
Warming pump/pad(s) | Braintree Scientific | HTP-1500 120V; AP-R 26E | For intraductal injection/preoperative preparation |