En metod för intraduktrisk injektion av reagenser för en etanol-baserade ablativ lösning på musen bröst duktal träd för in vivo imaging och bröstcancer förebyggande beskrivs. Injektion direkt i bröstvårtans öppning gör det möjligt att rikta in sig på bröst epitelceller med minimala skador på vävnad.
Bröstcancer är den vanligaste cancerformen och den näst vanligaste orsaken till cancerrelaterad död för kvinnor i USA. För högriskkvinnor är profylaktisk mastektomi den mest effektiva primära förebyggande strategin. Profylaktisk mastektomi är ett aggressivt kirurgiskt ingrepp som helt tar bort de bröst epitelceller från vilka bröstcancer uppstår tillsammans med den omgivande vävnaden. Vi försöker utveckla en minimalt invasiv intradukttal förfarande som ett alternativ till profylaktisk mastektomi att lokalt ablatera bröst epitelial cellerna innan de kan bli maligna. Vi och andra har utvecklat en intraduktrisk leverans förfarande för att nå och behandla dessa epitelial celler i gnagare modeller av bröstcancer. Medan mus bröstkörteln med en enda icke-anastomosed duktal trädöppning vid bröstvårtan har en mycket mindre komplex och plågsam arkitektur än det mänskliga bröstet, kemiskt inducerad och genetiskt konstruerade musmodeller av bröstcancer är värdefulla för att producera proof-of-concept studier av nya förebyggande strategier. Här beskriver vi ett förfarande för intraduktrisk leverans av en etanol-baserade ablativ lösning som innehåller micro-CT/röntgen tantal-baserade kontrastmedel inom musen bröst duktal träd för terapeutiska ändamålet primära förebyggande av bröstcancer. Intradukttal leverans av vattenhaltiga reagenser (t.ex. cytotoxiska föreningar, siRNAs, AdCre) har tidigare beskrivits i musmodeller. Således fokuserar vi vår protokollbeskrivning på metodologiska modifieringar och unika experimentella överväganden för att optimera leverans av etanol, för att minimera lokala och systemiska biverkningar av etanoladministration och för in vivo visualisering av duktal trädfyllning via mikro-CT / fluoroskopi imaging. Visualisering av duktalträdet omedelbart efter injektion av en kontrasthaltiga lösning möjliggör bekräftelse av fullständig fyllning eller misslyckade resultat som underfyllning eller överfyllning. Denna procedur kan tillämpas för leverans och avbildning av andra ablativa föreningar som syftar till antingen förhindra tumör bildas eller lokalt behandla tidiga tumörer tillgängliga via duktal träd.
Bröstcancer är en vanlig och potentiellt dödlig sjukdom med få alternativ tillgängliga för förebyggande1. Den mest effektiva interventionen är profylaktisk mastektomi; Emellertid, endast högrisk individer väljer att genomgå denna procedur eftersom det är en operation med stora livsförändrande konsekvenser2. Förfarandet tar helt bort de bröst epitelceller från vilka bröstcancer uppstår tillsammans med den omgivande vävnaden. Detta kan resultera i fysisk, psykisk och social stress för individen, och ofta avskräcker individer från att fortsätta med detta kirurgiska ingrepp som sin första rad av primära ingripande.
Vi har visat att leverans av en ablativ lösning som innehåller 70% etanol (EtOH) direkt i duktal träd är effektivt för att döda bröst epitelial celler med begränsad säkerhet vävnad skador och att förebygga bröst tumörer i mus modeller3. EtOH har länge använts kliniskt som ablativt eller skleroserande medel för lokal behandling. Perkutan EtOH injektion används som ett ablativt medel för ouppnåeliga levertumörer, njur- och binjurenematörplasmer och bukspottskörteln cystic tumörer4,5,6; för celiac plexus neurolys för att minska smärta7; och för behandling av bröst pseudoaneurysms8. Intravaskulära EtOH injektion används som skleroserande medel för att eliminera svullnad och deformation från arteriovenous missbildningar (AVM), och för kosmetisk behandling av spindelvener och åderbråck9,10,11,12,13. Liksom profylaktisk mastektomi beror framgången med förebyggande med lokal leverans av en ablativ lösning på förmågan att helt ta bort alla bröst epitelceller från vilka cancer potentiellt kan uppstå. Detta kräver bekräftelse på att det ablativa ämnet framgångsrikt har fyllt duktalträdet och därmed kontaktat alla bröst epitelceller direkt. Kliniska medel för att injicera ämnen i bröstkörtlarna och visualisera dem genom bildstyrd fluoroskopi eller duktografi är lätt tillgängliga14,15. Därför kommer det att vara möjligt att både leverera och bekräfta framgångsrik leverans när detta förfarande kan motivera utvärdering i kliniska prövningar.
Att påvisa genomförbarheten av denna bildstyrda metod i laboratoriedjur är ett viktigt steg för att fastställa effektiviteten och translationell genomförbarhet av intraduktal (ID) ablation som en förebyggande åtgärd för bröstcancer. I vårt laboratorium har vi utvecklat en metod för att framgångsrikt injicera alla bröstkörtlar hos möss med en ablativ lösning som innehåller ett kontrastmedel under en veckoinjektion för att säkerställa att djuret inte ger efter för en överdos av EtOH (figur 1, figur 2, referensnr. 3,16). Denna procedur placerar en 34 G nål inuti bröstvårtans öppning av en isofluran-sövd mus för att injicera testlösningen. Några viktiga förbättringar av förfarandet inkluderar användning av gastäta sprutor för vätska och gaser, injektion av högre volymer per duktal träd17 och utökad antiinflammatorisk behandling. Den prekliniska behandlingen av 5 mg/kg carprofen, ett NSAID, från 2 d före till 7 d efter ID-förfarandet är i linje med den kliniska sklerosbehandlingen för AVM. Vanligtvis, efter systemisk anestesi, patienterna får antiinflammatoriska läkemedel, såsom NSAID, i 2 dagar efter ingreppet som kan förlängas för att mildra eventuell lokal inflammation eller smärta12. Alkoholförgiftning mildras avsevärt genom intraperitoneal injektion av en 5% sackaroslösning hos möss. Med administrering av denna sackaroslösning kan möss injiceras säkert med upp till 160 μL av 70% EtOH (upp till fyra duktalträd; ca 0,4 g/dL EtOH-innehåll i blod); djur som helt återhämtat sig inom 4 timmar efter ID-injektioner. För injektion av mer än fyra körtlar hos möss och/eller högre EtOH koncentrationer, utför vi sekventiella sessioner för att tillåta tillräckligt med återhämtningstid. Alkoholförgiftning hos kvinnor skulle vara ett mindre problem på grund av den lägre andelen alkoholmängd till kroppsvikt. Med tanke på antalet duktalträd i mänskliga bröst14,15, cirka 16, och uppskattad volym för att fylla varje trädkanal18,19, kommer upp till 32 ml 70% EtOH att administreras. Denna mängd kommer att vara mycket lägre än 50 ml 95% EtOH administreras i andra kliniska förfaranden4,9. Intravenös administrering av tiamin- och glukoslösning kan användas för att ytterligare minimera effekterna av EtOH-förgiftning, särskilt i fall där en större total volym EtOH kan behöva injiceras och/eller för kvinnor som har en lägre tolerans mot alkoholkonsumtion (t.ex. allelicvarianter i alkohol eller aldehyddehydrogenaser).
Avbildning via mikro-CT/fluoroskopi gör det möjligt för oss att bekräfta framgångsrik duktal fyllning av varje körtel (figur 1, figur 2, figur 3). Detta kan registreras för framtida analys, eller bedömas i ögonblicket via fluoroskopiavbildning i realtid, som skulle göras vid klinisk tillämpning, för att begränsa den totala strålningsbördan som åläggs djuret. För att ytterligare förbättra specifika egenskaper hos denna ablativa lösning för bildstyrd leverans i realtid in vivo jämförde vi tidigare FDA-godkänd jodinnehållande kontrast till en tantaloxid (TaOx)-innehållande nanopartikel som syntetiserats av Shapiro lab3,16. TaOx visade överlägsen prestanda som ett mikro-CT kontrastmedel för att visualisera den första fyllningen av duktal träd (figur 2, figur 3). TaOx kan användas som referenskontrast för att utföra en mer systematisk och longitudinell bedömning av andra nanopartikelbaserade kontrastmedel i blodpoolen (t.ex. jod-, vismut- eller guldhaltigt) och kompatibilitet hos TaOx med olika koncentrationer av etylcellulosa som geleringsmedel20,21.
Profylaktisk mastektomi är för närvarande den mest effektiva interventionen för bröstcancer, men det har några allvarliga negativa effekter. Lokal ablation av bröst epitelial celler med en EtOH-baserad lösning är en lovande alternativ terapi som vi visade i en proof-of-concept studie på den aggressiva FVB-Tg-C3(1)-TAg mus modell av bröstcancer3. ID-injektion av denna ablativa lösning möjliggör inriktning av de bröst epitelceller från vilka bröstcancer uppstår med begränsad säkerhet skada. Tillägg av ett röntgenkontrastmedel till den ablativa lösningen möjliggör ökad förståelse för lösningens effektivitet vid förebyggande, eftersom vi kan se om varje duktalträd är framgångsrikt fyllt efter injektion (figur 2B). Att visa injicerade körtlar genom fluoroskopi omedelbart efter injektion speglar vad som sannolikt kommer att göras i kliniken för att bekräfta framgångsrik fyllning av duktalträdet. Visuell bekräftelse av lösningsleveransen informerar bäst om alla delar av trädet har nåtts i realtid. Detta kan göra det möjligt att utföra ytterligare injektion för att slutföra fyllningen vid den tidpunkten eller i en framtida session. Det är av stor vikt att ablativ lösning når alla delar av dukträdet för att säkerställa att alla epitelceller kan nås för avlivning (figur 3). Att lämna levande epitelceller i trädet skulle möjliggöra möjligheten att bröstcancer fortfarande kan uppstå. Använda kontrast i ID injektioner för att bild framgång av injektionen kan också vara användbart för andra formuleringar. Tabell 1 innehåller felsökning och användbara tips. Andra studier har beskrivit ID-leveransprotokoll för viruspartiklar (t.ex. AdCre, CRISPR guide RNAs), hormoner, cytotoxiska föreningar, siRNAs och/eller målmedel hos möss3,16,27,28,29,30,31,32,33,34,35,36,37 38, råttor24,32,39,40,41 och kaniner42,43,44,45,46,47. Oberoende kliniska studier rapporterade framgångsrika cannulation av upp till åtta kanaler per bröst för lokal leverans av kemoterapi40,48,49. Att visualisera full fyllning när man levererar andra lösningar som syftar till förebyggande eller inriktad på behandling skulle vara värt av liknande skäl. Vetskapen om att lösningen har nått alla grenar och terminala ändar av trädet kommer att vara informativ för att bedöma framgångsrik förebyggande eller behandling.
Vi känner inte till några andra intraduktala avbildningsmetoder hos möss33,34 eller andra djurmodeller47 som ger hög upplösning av TaOx nanopartiklar. Observera att TaOx i murin duktalträdet överträffar FDA-godkända kontrastmedel för diagnostisk dukografi3,16. När vi fortsätter att bedöma ID-ablativproceduren för dess förmåga att förhindra bröstcancer, kommer vi att kunna bestämma mer exakt från vilka körtlar cancer uppstår med hjälp av ytterligare data som ges genom avbildning efter ID-leverans. Till exempel kan man avgöra om en körtel som bara var delvis fylld är mer sannolikt än en icke-injicerad körtel att resultera i tumörbildning, som adresserar säkerhetsprofilen och oron för misslyckade injektioner på en högriskkvinna. Denna teknik har vissa begränsningar. Detta är en relativt utmanande musteknik som kräver fingerfärdighet och skicklighet hos operatören för att manipulera och framgångsrikt kanylera varje kanal. Varje enskild injektion är en oberoende händelse så misslyckad injektion på en eller flera körtlar kan äventyra resultat tolkning. Med tanke på storleken på mkörteln och skörheten i bröstvårtan är fluoroskopi eller liknande bildvägledningsteknik inte tillgänglig för att informera i realtid när infusionen ska stoppas. Denna realtidsbild-vägledning kommer att vara ett krav för klinisk implementering av lokal leverans av en ablativ lösning.
The authors have nothing to disclose.
Detta arbete stöddes delvis av National Cancer Institute R21 CA226579 och R01 CA258314 bidrag till LFS och av National Institute of Biomedical Imaging and Bioengineering R01 EB029418 bidrag till EMS. Vi vill tacka MSU Institute for Quantitative (IQ) Health Science and Engineering Imaging Core-anläggningen för användning av deras bildsystem och tekniska expertis. Vi vill tacka Dr. Danielle Ferguson för att ha granskat innehållet i videon och siffrorna för efterlevnaden av djurskyddsriktlinjerna.
AnalyzeDirect v12.0 | Caliper | n/a | For micro-CT image processing |
Carprieve, Carprofen 50 mg/mL | Allivet | 50647 | For anti-inflammatory treatment |
Evans blue | Sigma | E2129-50G | For injection visualization |
Hot water bath | Toolots | Yidu_HH-S2 | For preparing carprofen cups |
Imaris | Bitplane | n/a | For confocal image processing |
MediGel Sucralose Cups | ClearH2O | 74-02-5022 | For delivery of carprofen |
Model 1705 RN Syringe, 50μL | Hamilton | 7655-01 | For intraductal injection |
Photoshop 2021 | Adobe | n/a | For image processing |
Quantum GX2 microCT Imaging System | Perkin Elmer | CLS149276 | For micro-CT image acquisition |
Small Hub RN Needle, 34 gauge, custom (12° bevel angle, 0.375 in, point style 4) | Hamilton | 207434 | For intraductal injection |
Stereo Microscope SZM Series | AmScope | SM-4TPZ-144 | For intraductal injection |
Sterile blue food dye | McCormick | 930641 | For injection visualization |
Sterile phosphate buffered saline (PBS) | ThermoFisher | 14190250 | For solution preparation |
Stickers | DOT Scientific | DOTSCI-C50 | For preparing carprofen cups |
Sucrose | Calbiochem | 8550-5KG | For intraductal injection |
Syringes | Fisher | 14-826-79 | For preparing carprofen cups |
Vortex | VWR | 10153-834 | For preparing carprofen cups |
Warming pump/pad(s) | Braintree Scientific | HTP-1500 120V; AP-R 26E | For intraductal injection/preoperative preparation |