Análisis de la interacción de proteínas marcadas con fluorescentes con microvesículas de fosfolípidos artificiales utilizando citometría de flujo cuantitativa
Summary
Aquí, describimos un conjunto de métodos para caracterizar la interacción de proteínas con membranas de células o microvesículas.
Abstract
En el cuerpo humano, la mayoría de las principales reacciones fisiológicas involucradas en la respuesta inmune y la coagulación de la sangre proceden en las membranas de las células. Un primer paso importante en cualquier reacción dependiente de la membrana es la unión de la proteína en la membrana de fosfolípidos. Se ha desarrollado un enfoque para estudiar la interacción de las proteínas con las membranas lipídicas utilizando proteínas marcadas fluorescentemente y citometría de flujo. Este método permite el estudio de las interacciones proteína-membrana utilizando células vivas y vesículas de fosfolípidos naturales o artificiales. La ventaja de este método es la simplicidad y disponibilidad de reactivos y equipos. En este método, las proteínas se etiquetan utilizando colorantes fluorescentes. Sin embargo, se pueden utilizar proteínas autofabricadas y disponibles comercialmente, marcadas fluorescentemente. Después de la conjugación con un colorante fluorescente, las proteínas se incuban con una fuente de la membrana de fosfolípidos (microvesículas o células), y las muestras se analizan por citometría de flujo. Los datos obtenidos se pueden utilizar para calcular las constantes cinéticas y el equilibrio Kd. Además, es posible estimar el número aproximado de sitios de unión a proteínas en la membrana de fosfolípidos utilizando perlas de calibración especiales.
Introduction
Las biomembranas separan el contenido interno de las células animales y el espacio extracelular. Tenga en cuenta que las membranas también rodean las microvesículas formadas durante el ciclo de vida de la célula y los orgánulos. La membrana celular está compuesta predominantemente de lípidos y proteínas. Las proteínas de membrana realizan funciones de señalización, estructurales, de transporte y adhesivas. Sin embargo, la bicapa lipídica también es esencial para la interrelación de la célula animal con el espacio extracelular. Este artículo propone un método para estudiar la interacción periférica de las proteínas externas con la membrana lipídica.
El ejemplo más sorprendente de reacciones que ocurren en la capa de membrana externa de una célula animal es la reacción de coagulación de la sangre. Una característica importante de la coagulación sanguínea es que todas las reacciones principales proceden sobre las membranas fosfolípidas de las células y microvesículas que surgen de estas células y no en el plasma 1,2,3. Las reacciones dependientes de la membrana incluyen el proceso de inicio de la coagulación (en las membranas celulares del subendotelio, el endotelio inflamado o las células inmunes activadas, con la participación de un factor tisular), todas las reacciones de la principal activación en cascada de los factores IX, X, protrombina; activación del factor XI por trombina (en las membranas de plaquetas, eritrocitos, lipoproteínas y microvesículas activadas); reacciones de la vía de la proteína C; inactivación de enzimas de coagulación (en las membranas de las células endoteliales con la participación de cofactores de trombomodulina, receptor de proteína C endotelial, sulfato de heparán); y reacciones de vía de contacto (en membranas de plaquetas y algunas microvesículas con la participación de cofactores desconocidos). Por lo tanto, es imposible investigar la coagulación de la sangre sin estudiar la interacción de varias proteínas plasmáticas con la membrana de las células sanguíneas.
Este artículo describe un método basado en la citometría de flujo para caracterizar la interacción de las proteínas con las membranas lipídicas de las células o microvesículas. Este enfoque se propuso inicialmente para estudiar la interacción del plasma sanguíneo con plaquetas y vesículas artificiales de fosfolípidos. Además, la mayoría de las proteínas estudiadas interactúan directamente con fosfolípidos de membrana cargados negativamente, particularmente con fosfatidilserina 4,5. Además, hay proteínas cuya interacción con la membrana está mediada por receptores especiales6.
Una capacidad importante de la citometría de flujo es discriminar entre ligandos libres y unidos sin separación adicional. Esta característica de la citometría permite el estudio de la unión al equilibrio del ligando en el punto final y ayuda a realizar mediciones cinéticas continuas. La técnica es poco sofisticada y no requiere una preparación de muestras compleja. La citometría de flujo se utiliza activamente para estudiar cuantitativamente la dinámica de la interacción entre péptidos fluorescentes, receptores y proteínas G en neutrófilos intactos y permeables a detergente7. Este enfoque también es aplicable para explorar las interacciones proteína-ADN y la cinética de la actividad de la endonucleasa en tiempo real8. Con el tiempo, este método se utilizó para estudiar cuantitativamente las interacciones proteína-proteína de alta afinidad con vesículas lipídicas purificadas9, o, más generalmente, con proteínas de membrana expresadas en un sistema de expresión celular Sf9 altamente eficiente10. También se han descrito métodos cuantitativos para caracterizar las interacciones proteína-liposoma mediante citometría de flujo para proteínas transmembrana11.
Esta técnica utiliza perlas de calibración hechas por ellos mismos para evitar el uso de cuentas disponibles comercialmente7. Las perlas de calibración utilizadas anteriormente7 estaban destinadas a trabajar con fluoresceína, lo que restringía sustancialmente la variedad de ligandos fluorescentes accesibles en las proteínas. Además, este documento ofrece una nueva forma de adquirir y analizar datos cinéticos para una resolución de tiempo razonable. Aunque este método se describe para vesículas de fosfolípidos artificiales, no hay limitaciones obvias para su adaptabilidad a células, vesículas naturales o vesículas de fosfolípidos artificiales con una composición lipídica diferente. El método aquí descrito permite la estimación de los parámetros de interacción (kon, koff) y equilibrio (Kd) y facilita la caracterización cuantitativa del número de sitios de unión a proteínas en la membrana. Tenga en cuenta que esta técnica proporciona una estimación aproximada del número de sitios de unión. Las ventajas del método son su relativa simplicidad, accesibilidad y adaptabilidad a células nativas y microvesículas naturales y artificiales.
Protocol
Representative Results
Discussion
El método propuesto se puede adaptar para una caracterización aproximada de la interacción de proteínas con membranas de fosfolípidos de diversas fuentes y composiciones. La citometría de flujo cuantitativa descrita aquí concede a la resonancia de plasmón de superficie (SPR) en varios parámetros. En particular, tiene una menor sensibilidad y resolución de tiempo y requiere un etiquetado fluorescente de proteínas. El etiquetado fluorescente puede conducir a un cambio en la conformación y la pérdida de activid…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Los autores fueron apoyados por una subvención de la Fundación Rusa de Ciencia 20-74-00133.
Materials
| A23187 | Sigma Aldrich | C7522-10MG | |
| Alexa Fluor 647 NHS Ester (Succinimidyl Ester) | Thermo Fisher Scientific | A37573 | fluorescent dye |
| Apyrase from potatoes | Sigma Aldrich | A2230 | |
| BD FACSCantoII | BD Bioscience | ||
| bovine serum albumin | VWR Life Science AMRESCO | Am-O332-0.1 | |
| Calcium chloride, anhydrous, powder, ≥97% | Sigma Aldrich | C4901-100G | |
| Cary Eclipse Fluorescence Spectrometer | Agilent | ||
| D-(+)-Glucose | Sigma Aldrich | G7528-1KG | |
| DiIC16(3) (1,1'-Dihexadecyl-3,3,3',3'-Tetramethylindocarbocyanine Perchlorate) | Thermo Fisher Scientific | D384 | |
| DMSO | Sigma Aldrich | D8418 | |
| EDTA disodium salt | VWR Life Science AMRESCO | Am-O105B-0.1 | |
| FACSDiva | BD Bioscience | cytometry data acquisition software | |
| FlowJo | Tree Star | cytometer software for data analysis | |
| HEPES | Sigma Aldrich | H4034-500G | |
| Human Factor X | Enzyme research | HFX 1010 | |
| Hydroxylamine hydrochloride | Panreac | 141914.1209 | |
| L-α-phosphatidylcholine (Brain, Porcine) | Avanti Polar Lipids | 840053P | |
| L-α-phosphatidylserine (Brain, Porcine) (sodium salt) | Avanti Polar Lipids | 840032P | |
| Magnesium chloride | Sigma Aldrich | M8266-100G | |
| Mini-Extruder | Avanti Polar Lipids | 610020-1EA | |
| OriginPro 8 SR4 v8.0951 | OriginLab Corporation | Statistical software | |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) Tablets, Biotechnology Grade | VWR Life Science AMRESCO | 97062-732 | |
| Potassium chloride | Sigma Aldrich | P9541-500G | |
| Prostaglandin E1 | Cayman Chemical | 13010 | |
| Sephadex G25 | GE Healthcare | GE17-0033-01 | gel filtration medium for protein purification |
| Sepharose CL-2B | Sigma Aldrich | CL2B300-500ML | gel filtration medium for platelet purification |
| Sodium bicarbonate | Corning | 61-065-RO | |
| Sodium chloride | Sigma Aldrich | S3014-500G | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma Aldrich | S3139-250G | |
| Spin collumns with membrane 0.2 µm | Sartorius | VS0171 | |
| Trisodium citrate dihydrate | Sigma Aldrich | S1804-1KG |
References
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