Phormidium lacuna представляет собой нитевидную цианобактерию, которая была выделена из морских скальных бассейнов. В данной статье описывается выделение нитей из природных источников, экстракция ДНК, секвенирование генома, естественная трансформация, экспрессия sfGFP, криоконсервация и методы подвижности.
Цианобактерии находятся в центре внимания фундаментальных исследований и биотехнологических проектов, в которых солнечная энергия используется для производства биомассы. Phormidium lacuna представляет собой недавно выделенную нитевидную цианобактерию. В этой статье описывается, как новые нитевидные цианобактерии могут быть выделены из морских скальных бассейнов. В нем также описывается, как ДНК может быть извлечена из нитей и как геномы могут быть секвенированы. Хотя трансформация устанавливается для многих одноклеточных видов, она реже регистрируется для нитевидных цианобактерий. Здесь описан упрощенный метод естественного превращения P. lacuna. P. lacuna является единственным членом отряда Oscillatoriales, для которого установлена естественная трансформация. В этой статье также показано, как естественная трансформация используется для экспрессии суперпапки зеленого флуоресцентного белка (sfGFP). Эндогенный промотор cpcB индуцировал примерно в 5 раз более сильную экспрессию, чем промоторы cpc560, A2813 или psbA2 от Synechocystis sp. PCC6803. Далее установлен способ криоконсервации P. lacuna и Synechocystis sp.CPP 6803, описаны методы оценки подвижности в жидкой среде и на агаровой и пластической поверхностях.
Цианобактерии являются прокариотическими организмами, которые используют фотосинтез в качестве источника энергии 1,2. Исследования все больше фокусируются на видах цианобактерий. Несколько цианобактерий могут быть преобразованы с помощью ДНК3. Гены могут быть выбиты или переэкспрессированы у этих видов. Тем не менее, трансформация ограничена несколькими видами 4,5,6,7,8,9,10,11, и может быть трудно установить трансформацию в штаммах из коллекций культур или диких8. Штаммы нитевидных видов Phormidium lacuna (рисунок 1) были выделены из морских скальных бассейнов, в которых условия окружающей среды, такие как концентрации соли или температура, колеблются с течением времени. Эти нитчатые цианобактерии могут быть использованы в качестве модельных организмов для отряда Oscillatoriales12, к которому они принадлежат.
В ходе испытаний, тестирующих перенос генов электропорацией13,14, было установлено, что P. lacuna может быть преобразована естественной трансформацией15. В этом процессе ДНК естественным образом поглощается некоторыми клетками. По сравнению с другими методами преобразования 16,17, естественное преобразование имеет то преимущество, что не требует дополнительных инструментов, которые могли бы усложнить процедуру. Например, электропорация требует правильных кювет, неповрежденных проводов и выбора правильного напряжения. P. lacuna в настоящее время является единственным членом Oscillatoriales, восприимчивым к естественной трансформации. Поскольку оригинальный протокол основан на протоколах электропорации, он по-прежнему включал в себя несколько этапов промывки, которые могут быть ненужными. Различные подходы были протестированы для упрощения протокола, что привело к протоколу преобразования, представленному здесь.
Последовательность генома необходима для дальнейших молекулярных исследований, основанных на нокауте гена или сверхэкспрессии. Хотя последовательности генома могут быть получены с помощью машин секвенирования следующего поколения в течение коротких периодов времени, извлечение ДНК может быть затруднено и зависит от вида. С P. lacuna было протестировано несколько протоколов. Затем был установлен модифицированный метод на основе цетилтриметиламммония бромида (CTAB), что привело к приемлемой чистоте ДНК и выходам ДНК каждого цикла очистки для продолжения работы в лаборатории. Геном пяти штаммов может быть секвенирован с помощью этого протокола. Следующим логическим этапом трансформации было установление экспрессии белка в P. lacuna.
SfGFP, используемый в качестве маркерного белка в этом протоколе, может быть обнаружен с помощью любого флуоресцентного микроскопа. Все промоторы, которые были протестированы, могут быть использованы для экспрессии P. lacuna sfGFP. Увеличение числа штаммов, возникающих в результате трансформации, привело к необходимости метода хранения культур. Такие методы установлены для кишечной палочки и многих других бактерий18. В стандартных протоколах глицериновые культуры готовят, переносят в жидкий азот и хранят при -80 °C. Этот метод требует всего нескольких шагов и является высоконадежным для тех видов, для которых он установлен. Стандартный протокол был неосуществим для P. lacuna, поскольку живые клетки не могли быть восстановлены во всех случаях. Однако, когда глицерин был удален после оттаивания, клетки всех испытаний выжили. Представлены простые методы анализа подвижности P. lacuna, которые можно комбинировать с нокаутным мутагенезом для исследования пили IV типа или роли фоторецепторов. Эти анализы отличаются от анализов одноклеточных цианобактерий 19,20,21 и также могут быть полезны для других Осцилляторий.
Хотя многие штаммы цианобактерий доступны из коллекций культур 32,33,34,35,36, все еще существует спрос на новые цианобактерии из дикой природы, потому что эти виды адаптированы к конкретным свойствам. <e…
The authors have nothing to disclose.
Работа была поддержана Технологическим институтом Карлсруэ.
Autoclave 3870 ELV | Tuttnauer | 3870 ELV | |
Bacto Agar | OttoNorwald | 214010 | |
BG-11 Freshwater Solution | Sigma Aldrich | C3061 | |
BG-11 medium | Merck | 73816-250ML | |
Boric acid | Merck | 10043-35-3 | H3BO3 |
Calcium chloride dihydrate | Carl Roth | 10035-04-8 | CaCl2 · 2 H2O |
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 250 mL | Greiner | 658190 | |
Cell culture flasks Cellstar with filter screw cap, sterile, 50 mL | Greiner | 601975 | |
Centrifuge LYNX 4000 | Thermo Scientific | 75006580 | and rotor |
Centrifuge microstar 17 | VWR International | N/A | for up to 13,000 rpm |
Cetyltrimethylammonium Bromide (CTAB) | PanReac AppliChem | 57-09-0 | C19H42BrN |
Chloroform : Isoamyl Alcohol 24 : 1 | PanReac AppliChem | A1935 |
|
Cobalt(II) chloride hexahydrate | Merck | 7791-13-1 | CoCl2 · 6 H2O |
Copper(II) sulphate pentahydrate | Merck | 7758-99-8 | CuSO4 · 5 H2O |
D(+)-Biotin | Carl Roth | 58-85-5 | C10H16N2O3S |
DNA ladder 1 kb | New England Biolabs | N3232 | |
DNA ladder 100 bp | New England Biolabs | N3231 | |
Electrical pipetting help accujet-pro S | Brand GmbH | 26360 | for pipetting 1-25 mL |
Ethanol | VWR | 64-17-5 | C2H6O |
Ethylenediamine tetraacetic acid disodium salt dihydrate | Carl Roth | 6381-92-6 | EDTA-Na2 · 2 H2O |
Fluorescence microscope ApoTome | Zeiss | ||
Fluorescence microscope Axio Imager 2 | Zeiss | ||
French Pressure Cell Press | American Instrument Company | N/A | |
Gel documation System Saffe Image | Invitrogen | ||
Gelelctrophoresis system Mupid-One/-exu | ADVANCED | ||
Glassware, different | |||
Glycerol | Carl Roth | 56-81-5 | C3H8O3 |
Iron(III) chloride hexahydrate | Merck | 10025-77-1 | FeCl3 · 6 H2O |
Kanamycin | Sigma-Aldrich | 25389-94-0 | |
Kanamycin sulphate | Carl Roth | 25389-94-0 | C18H36N4O11 · H2SO4 |
Lauroylsarcosine, Sodium Salt (Sarcosyl) | Sigma Aldrich | 137-16-6 | C15H28NO3 · Na |
LB Broth (Lennox) | Carl Roth | X964.4 | |
Light source, fluorescent tube L18W/954 daylight | OSRAM | cultivation of cyanobacteria | |
Light source, LED panel XL 6500K 140 W | Bloom Star | N/A | cultivation of cyanobacteria, up to 1,000 µmol m-2 s-1 |
Magnesium chloride hexahydrate | Carl Roth | 7791-18-6 | MgCl2 · 6 H2O |
Manganese(II) chloride tetrahydrate | Serva | 13446-34-9 | MnCl2 · 4 H2O |
Microscope DM750 | Zeiss | ||
Midi prep plasmid extraction kit NucleoBond Xtra Midi kit | Macherey-NAGEL GmbH & Co. KG | REF740410.50 | |
Minicomputer Raspberry Pi 4 + | Conrad Electronics | 2138863-YD | for time-lapse recording |
Ocular camera EC3 | Leica | for continuous recording up to 30 s | |
Ocular camera MikrOkular Full HD | Bresser | for time-lapse recordings, coupled to Raspberry Pi minicomputer | |
Petri dishes polystyrole, 100 mm x 20 mm | Merck | P5606-400EA | |
Petri dishes polystyrole, 60 mm x 15 mm | Merck | P5481-500EA | |
Photometer Nanodrop ND-1000 | Peqlab Biotechnologie | ||
Photometer Uvikon XS | Goebel Instrumentelle Analytik GmbH | ||
Pipetman 100-1,000 µL | Gilson | SKU: FA10006M | |
Pipetman 10-100 µL | Gilson | SKU: FA10004M | |
Plastic pipettes 10 mL, sterile | Greiner | 607107 | |
Plastic tube, sterile, 15 mL | Greiner | 188271 | |
Plastic tube, sterile, 50 mL | Greiner | 227261 | |
Potassium bromide | Carl Roth | 7758-02-3 | KBr |
Potassium chloride | Carl Roth | 7447-40-7 | KCl |
Power supply Statron 3252-1 | Statron Gerätetechnik GmbH | ||
Power supply Voltcraft PPS 16005 | Conrad Electronics | for LED | |
Proteinase K | Promega | MC500C | from Maxwell 16 miRNA Tissue Kit AS1470 |
Q5 polymerase | New England Biolabs | M0491S | |
Sequencing kit NextSeq 500/550 v2.5 | Illumina | ||
Sequencing system NextSeq 550 SY-415-1002 | Illumina | ||
Shaker Unimax 2010 | Heidolph Instruments | for cultivation | |
Sodium acetate | Carl Roth | 127-09-3 | NaCH3COO |
Sodium chloride | Carl Roth | 7647-14-5 | NaCl |
Sodium dihydrogen phosphate monohydrate | Carl Roth | 10049-21-5 | NaH2PO4 · H2O |
Sodium fluoride | Carl Roth | 7681-49-4 | NaF |
Sodium hydrogen carbonate | Carl Roth | 144-55-8 | NaHCO3 |
Sodium molybdate dihydrate | Serva | 10102-40-6 | Na2MoO4 · 2 H2O |
Sodium nitrate | Merck | 7631-99-4 | NaNO3 |
Sodium sulphate | Carl Roth | 7757-82-6 | Na2SO4 |
Strontium chloride hexahydrate | Carl Roth | 10025-70-4 | SrCl2 · 6 H2O |
Thiamine hydrochloride | Merck | 67-03-8 | C12H17ClN4OS · HCl |
TRIS | Carl Roth | 77-86-1 | C4H11NO3 |
Ultrasonic device UP100H with sonotrode MS3 | Hielscher Ultrasound Technology | UP100H | |
Ultraturrax Silent Crusher M | Heidolph Instruments | homogenizer | |
Urea | Carl Roth | 57-13-6 | CH4N2O |
Vitamin B12 | Sigma | 68-19-9 | C63H88CoN14O14P |
Vitamin solution | 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin | ||
Water Stills, Water treatment | VEOLIA water technologies | ELGA_21001 | |
Zinc sulphate heptahydrate | Sigma | 7446-20-0 | ZnSO4 · 7 H2O |
software, URL | |||
gatb-minia program for DNA assembly | https://github.com/GATB/gatb-minia-pipeline | makes large scaffolds from short DNA reads, Linux based | |
ImageJ | software for immage processing (pixel intensities, circle diameter) | ||
RAST annotation server | https://rast.nmpdr.org | input: genome DNA sequence, detects open reading frames, lists protein sequences and their functions | |
Culture media | |||
Artificial seawater | 0.41 M NaCl , 53 mM MgCl2,28 mM Na2SO4, 10 mM CaCl2 , 9 mM KCl , 2.4 mM NaHCO3 ,0.84 mM KBr, 0.49 mM H3BO3, 90 µM SrCl2, 72 µM NaF | ||
f/2 -liquid medium | artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution, 0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 | ||
f/2+ liquid medium | f/2-medium, with 10 times increased NaNO3 and NaH2PO4 (0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 | ||
f/2+-agar | 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,8.8 mM NaNO3, 0.36 mM NaH2PO4 | ||
f/2-agar | 3 % (w/v) bacto agar, artificial seawater, 0.1 % (v/v) trace element solution, 0.05 % (v/v) vitamin solution ,0.88 mM NaNO3, 36 µM NaH2PO4 | ||
Trace element solution | 0.36 mM NaH2PO4, 12 µM Na2EDTA, 39 nM CuSO4, 26 nM Na2MoO4 , 77 nM ZnSO4, 42 nM CoCl2, 0.91 µM MnCl2 | ||
Vitamin solution | 0.3 µM thiamin-HCl, 2.1 nM biotin, 0.37 nM cyanocobalamin |