我们使用标准的听觉脑干反应(ABR)技术,并将其应用于孵化鸡,这是一种用于听觉功能的早熟鸟类模型。该协议详细概述了动物准备和ABR获取技术,以及可以转化为其他鸟类或啮齿动物模型的步骤。
听觉脑干反应(ABR)是临床听力学,非人类动物和人类研究中的宝贵测定。尽管ABR在测量听觉神经同步性和估计其他脊椎动物模型系统中的听力敏感性方面被广泛使用,但在近四十年中还没有报道在鸡中记录ABR的方法。鸡提供了一个强大的动物研究模型,因为它们的听觉系统在晚期胚胎和早期孵化阶段接近功能成熟。我们已经演示了用于在鸡幼鸡中使用皮下针电极阵列引发单通道或双通道ABR记录的方法。无论电极记录配置如何(即蒙太奇),ABR记录在超阈值点击激励的前6ms内包括3-4个正向峰值波形。在高强度水平下,峰至谷波形幅度范围为2-11 μV,正峰值表现出预期的延迟强度函数(即,延迟增加与强度降低的函数关系)。标准化的耳机位置对于最佳录音至关重要,因为松弛的皮肤会阻塞耳道,而动物运动可以移开刺激传感器。随着动物体温的降低,峰值振幅更小,潜伏期更长,支持维持生理体温的需要。对于幼雏(孵化后<3 h),阈值升高约5 dB,峰值潜伏期增加~1-2 ms,峰至谷幅度降低~1 μV。这表明存在潜在的导电相关问题(即中耳腔积液),应考虑用于幼雏。总体而言,这里概述的ABR方法允许准确和可重复地记录鸡幼崽的 体内 听觉功能,可以应用于不同的发育阶段。这些发现很容易与人类和哺乳动物的听力损失,衰老或其他听觉相关操作模型进行比较。
对声音刺激的诱发神经反应的研究可以追溯到半个多世纪1。听觉脑干反应(ABR)是一种诱发电位,几十年来一直被用作非人类动物和人类听觉功能的衡量标准。人类 ABR 呈现五到七个波形峰,通常用罗马数字 (I-VII)2 标记。这些峰值根据其延迟(以毫秒为单位的发生时间)和振幅(以微伏为单位的峰谷大小)来分析神经反应。ABR有助于评估听觉神经的功能和完整性以及脑干和听力阈值敏感性。听觉系统中的缺陷导致ABR潜伏期和振幅的缺失,减少,延长或异常。值得注意的是,这些参数在人类和其他动物中几乎相同,使其成为脊椎动物模型3中听觉功能的一致客观测试。
一个这样的模型系统是鸡,由于各种原因,它特别有用。鸟类可分为无节性或早熟性 4.雌雄异鸟在感官发育的同时孵化;例如,谷仓猫头鹰直到孵化后四天才显示出一致的ABR5。早熟的动物,如鸡孵化,具有近乎成熟的感官。听力的发作发生在胚胎发育中,使得在孵化前几天(胚胎第21天),听觉系统接近功能成熟6,7,8。无菌鸟类和大多数哺乳动物模型容易受到影响发育的外在因素的影响,并且需要畜牧业,直到听力成熟。鸡的ABR可以在孵化的同一天进行,因为不需要喂养或丰富的环境。
胚胎鸡一直是生理学和发育的经过充分研究的模型,特别是在听觉脑干中。具体结构包括鸡耳蜗核,分为木兰细胞核(NM)和核无柄细胞核(NA),以及内侧上橄榄核的鸟类相关性,称为核层(NL)6,7。ABR是专注于前脑和皮层水平之前的中枢听觉功能的理想选择。体内ABR测量与发育8,生理学9,tonotopy 10和遗传学11,12的体外神经元研究之间的转换提供了理想的研究机会,支持整体听觉功能的研究。
尽管ABR已经在哺乳动物模型中得到了广泛的研究,但对鸟类的关注却较少。以前的鸟类ABR研究包括鹦鹉13,啄木鸟14,海鸥15,潜水鸟16,斑马雀17,昼夜猛禽18,金丝雀19,猫头鹰3种5,20,21,22和鸡23的表征。鉴于自上次对鸡ABR进行彻底表征以来的近四十年时间里,以前使用的许多设备和技术都发生了变化。来自其他鸟类模型研究的见解可以帮助开发现代鸡ABR方法,同时也可以与鸡ABR进行比较。本文将概述实验设置和设计,以便在孵化鸡中进行ABR记录,这也可以应用于胚胎发育阶段以及其他小型啮齿动物和鸟类模型。此外,鉴于鸡的早熟发育,可以在没有任何广泛畜牧业的情况下进行发育操作。对发育中的胚胎的操作可以在具有接近成熟听力能力的动物孵化后几个小时内进行评估。
鸟类的听觉脑干得到了很好的研究,许多结构类似于哺乳动物的听觉通路。听觉神经为两个一阶中央细胞核(乳腺细胞核 (NM) 和角质细胞 (NA))提供兴奋性输入。NM将兴奋性投射双侧发送到其听觉靶标,即层核(NL)7。NL投射到侧侧中脑核,背鳍核(MLd)40,41。NL还投射到上橄榄核(SON),其为NM,NA和NL42提供反馈抑制。这种下听觉脑干微电路因其功能,声音定位和双耳听力33而得到精心保存。鸟类的上听觉脑干区域也具有类似于哺乳动物外侧脑和中脑下丘脑的细胞核。鉴于这些相似性,鸟类ABR到听觉中脑的组成在所有脊椎动物中都是相当的。
虽然多种鸟类在刺激开始后6 ms内显示出三个正峰,但ABR峰与中央听觉结构的相关性确实具有一定的可变性。可以合理地假设波I是来自外周基底和听觉神经的第一个神经反应,并且在个体之间几乎没有变异性(图1C)。随后的波浪识别不太确定,并且可能因物种而异。Kuokkanen等人17 最近确定谷仓猫头鹰的ABR的第三波是由NL产生的;因此,有理由认为Wave II起源于耳蜗核20的NM和NA。然而,猫头鹰Wave III被定义为刺激开始后3 ms产生的正峰值。这对应于孵化鸡ABR中定义的Wave II。在谷仓猫头鹰ABR中,波浪I和II被组合在一起。
虽然雏鸡通常在6 ms内出现三个峰,但偶尔观察到第四个峰(例如,见 图1A)。需要总体数据,更大的样本量和额外的实验范式来支持第四波,在某些情况下,还需要五波鸡ABR。最一致的发现是此处显示的三个峰值表示。
由于ABR被定义为神经同步性的量度,因此听觉通路中的主要细胞核可以代表ABR中的每个正向峰。从听觉神经传递到NM / NA然后到NL的信号可能分别定义孵化鸡ABR中的I,II和III波。此外,后来发生的鸡的第四峰ABR可能代表上脑干或中脑听觉结构。鸟类ABRs的特征还应考虑早熟鸟类和无菌鸟类之间的差异。听觉反应的成熟会因物种而异,并且还受到捕食者行为和/或声音学习等其他关键特征的影响4.无论如何,所描述的方法和技术很容易应用于各种鸟类和脊椎动物物种。
维持动物体温的重要性如图 2所示。随着内部体温的降低,在相同的刺激强度水平下,ABR反应的潜伏期增加。当体温降至32°C以下36,37时,这更为明显。ABR中大约1毫秒的延迟增加小于之前在鸡23中报告的。然而,片山23 号使用了一只12天大的幼雏,该幼雏冷却并在4小时内变暖。 图2 中的数据是在20分钟的冷却过程中记录的。为了获得最佳质量和最一致的记录,必须保持动物的体温,并且所有记录都应在动物之间的相同生理温度下进行。
年龄对ABR的影响很小,但重要的是要考虑。虽然只有ABR的Waves I和Wave II的延迟显着不同,但这部分是因为 图3中仅使用了三个幼雏;其他三个没有出现三个可识别的ABR峰。如果使用大样本量或比较频率特异性ABR,ABR幅度和阈值偏移也可能很明显。这种与年龄有关的影响可能是由鸡中耳中的液体引起的。这种导电变化导致人类和其他哺乳动物模型的ABR阈值显着增加38,39。
使用两种不同的记录蒙太奇,观察到类似的响应(图4A)。虽然最常见的蒙太奇将参比电极放在刺激接收耳的后面,但如果伴随ABR进行手术干预,则将参比电极放在颈部组织中是有用的。但是,如果使用双通道ABR记录,参比电极应单独对称放置,如果将参比电极放在颈部,则很难。建议使用参比电极的乳突位置,以标准化尽可能多的记录方面。双通道ABR录音是一种有效的工具,几乎不需要额外的准备,并且在耳朵之间产生类似的反应。微小的振幅差异可能是由于耳机的位置造成的。双通道记录允许将实验操纵的耳朵或大脑半球与对照进行比较。测试双耳ABR也需要此设置。未来使用鸡ABR的实验可以参考以前关于记录配置和蒙太奇的文献34。
这种方法确实存在一些限制。如步骤5.1所述,不良的窥器放置可能导致响应中40 dBSPL的偏移。这可能会导致对纵或改良的动物的错误解释。建议采取以下预防措施:在获取操纵或突变模型的ABR之前,先获取大量对照数据样本。不要在两次录制之间将刺激强度降低超过 20 dBSPL。如果振幅或潜伏期变化超过预期,请检查动物和窥器位置。重复ABR刺激以观察变化。如果窥器已移动,请重新获取以前的测试。另一个限制是ABR的校准。如果没有适当的校准来记录声压级,呈现给动物的强度是未知的。测量声音输出时,使用与实验录音相同的窥器,并在腔内使用接近动物耳道长度(〜5 mm)的小麦克风。测量实验中使用的相同音调频率,因为校准是特定于频率的。硬件和软件系统的手册可能附带校准说明。还有额外的滤波器,如线性相位和最小相位滤波器,可以改善咔嗒声和音调突发ABR43。本研究未使用这些过滤器。其他考虑因素,例如音调突发频谱包络的上升和下降时间作为频率的函数而变化或改变点击刺激的上升和下降时间也没有被检查。一旦可以获得可靠和一致的ABR,这些都是良好的未来调查。
将孵化鸡与其他鸟类模型进行比较是有希望的。Budgerigars和东部尖叫猫头鹰在ABR13,22的前6 ms内也显示出三个正微伏峰值。在不同种类的啄木鸟中,也可以看到三个峰值,但它们的延迟时间较晚。此外,啄木鸟的最佳频率灵敏度范围在1500至4000 Hz之间,略高于鸡在1000 Hz时的最佳阈值。在成年鸡中,最好的灵敏度是2000 Hz35,因此随着鸡幼崽发育成成体,高频的听力可能会得到改善。考虑到动物的萎缩或早熟发育,这种发育在鸟类物种之间会有所不同4.
这里概述的实验方法可以帮助确定哪些因素导致听觉反应和阈值的损害或变化,以及胚胎发育不同阶段的研究。遗传操纵,衰老和噪音暴露都是已知的动物和其他鸟类模型中的操纵24,25,44,45。这些方法应该扩展到鸡模型,因为像 内卵 电穿孔这样的技术允许在听觉脑干的一侧进行局灶性和时间控制的蛋白质的表达12,46。这允许使用双通道记录范式将ABR从遗传操纵的耳朵到对侧控制耳朵的直接比较。
总体而言,孵化鸡的ABR是一种有用的研究方法,几乎与人类和其他哺乳动物模型中的听力功能测量相同。它也是一种非侵入性的 体内 方法。除了麻醉剂注射和几毫米的皮下电极放置外,不需要其他物理操作。理论上,如果将其保持在适当的环境中,则可以在几天或几周的发育时间内对幼雏进行多次测试。该协议不仅列出了孵化鸡ABR的必要步骤和记录参数,而且还提出了禽类ABR的特征,可以为进一步测试听觉脑干功能提供信息。
The authors have nothing to disclose.
这项工作由NIH / NIDCD R01 DC017167支持
1/8 inch B&K Microphone | Brüel & Kjær | 4138 | Type 4138-A-015 also works |
Auditory Evoked Potential Universal Smart Box | Intelligent Hearing Systems | M011110 | |
Custom Sound Isolation Chamber | GK Soundbooth Inc | N/A | Custom built |
DC Power Supply | CSI/Speco | PSV-5 | |
ER3 Insert Earphone | Intelligent Hearing Systems | M015302 | Used as sound transducer |
Euthasol | Virbac | 710101 | Controlled Substance; euthanasia solution |
Insulin Syringe (29 G) | Comfort Point | 26028 | |
Ketamine | Covetrus | 11695-0703-1 | Controlled Substance |
Power Supply | Powervar | 93051-55R | |
Rectal Probe | YSI | 401 (10-09010) | Any 400 series probe will work with the YSI temperatuer monitor |
Subdermal needles | Rhythmlink | RLSND107-1.5 | |
Temperature Monitor | YSI | 73ATA 7651 | Works with any 400 series rectal probe |
Xylazine | Anased | 59399-110-20 | Used with ketamine and water for anesthetic |