Vi har brukt standard auditive hjernestammeresponsteknikker (ABR) og brukt dem på hatchling kyllinger, en forgjengelig fuglemodell for auditiv funksjon. Protokollen skisserer dyreforberedelse og ABR-oppkjøpsteknikker i detalj, med trinn som kan oversettes til andre fugle- eller gnagermodeller.
Den auditive hjernestammeresponsen (ABR) er en uvurderlig analyse i klinisk audiologi, ikke-menneskelige dyr og menneskelig forskning. Til tross for den utbredte bruken av ABR-er i måling av auditiv nevral synkron og estimering av hørselsfølsomhet i andre virveldyrmodellsystemer, har metoder for registrering av ABR i kyllingen ikke blitt rapportert på nesten fire tiår. Kyllinger gir en robust dyreforskningsmodell fordi deres hørselssystem er nær funksjonell modning i sen embryonale og tidlige klekkestadier. Vi har demonstrert metoder som brukes for å fremkalle en eller tokanals ABR-opptak ved hjelp av subdermale nåleelektrodekjeder i kylling hatchlings. Uavhengig av elektrodeopptakskonfigurasjon (dvs. montasje), inkluderte ABR-opptak 3-4 positive toppbølgeformer i løpet av de første 6 ms av en suprathreshold klikk stimulans. Topp-til-trough bølgeform amplituder varierte fra 2-11 μV på høyintensitetsnivåer, med positive topper som viser forventede latensintensitetsfunksjoner (dvs. økning i latens som en funksjon av redusert intensitet). Standardisert øretelefonposisjon var avgjørende for optimale opptak da løs hud kan okkludere ørekanalen, og dyrebevegelse kan løsne stimulanstransduseren. Toppamplituder var mindre, og latencies var lengre etter hvert som dyrekroppstemperaturen senket, og støttet behovet for å opprettholde fysiologisk kroppstemperatur. For unge hatchlings (<3 h post-hatch dag 1), terskler ble forhøyet med ~ 5 dB, peak latencies økte ~ 1-2 ms, og topp til trough amplitudes ble redusert ~ 1 μV sammenlignet med eldre hatchlings. Dette antyder et potensielt ledende problem (dvs. væske i mellomørehulen) og bør vurderes for unge hatchlings. Samlet sett tillater ABR-metodene som er skissert her, nøyaktig og reproduserbar registrering av in-vivo auditiv funksjon i kyllingluker som kan brukes på forskjellige utviklingsstadier. Slike funn sammenlignes lett med menneskelige og pattedyrmodeller av hørselstap, aldring eller andre hørselsrelaterte manipulasjoner.
Studien av fremkalte nevrale responser på lydstimuli dateres tilbake over et halvt århundre1. Den auditive hjernestammeresponsen (ABR) er et fremkalt potensial som har blitt brukt som et mål på auditiv funksjon hos både ikke-menneskelige dyr og mennesker i flere tiår. Den menneskelige ABR presenterer med fem til syv bølgeform topper konvensjonelt merket av romerske tall (I-VII)2. Disse toppene analyseres basert på ventetid (forekomsttid i millisekunder) og amplitude (topp-til-trough-størrelse i mikrovolt) av nevrale responser. ABR er medvirkende til å evaluere funksjonen og integriteten til hørselsnerven, samt hjernestamme og hørselsterskelfølsomhet. Underskudd i hørselssystemet fører til fraværende, reduserte, langvarige eller unormale ABR-ventetider og amplituder. Bemerkelsesverdig er disse parametrene nesten identiske hos mennesker og andre dyr, noe som gjør det til en konsekvent objektiv test av auditiv funksjon på tvers av virveldyrmodeller3.
Et slikt modellsystem er kyllingen, og det er spesielt nyttig av en rekke årsaker. Fugler kan klassifiseres som altricial eller precocial4. Altricial fugler klekkes med sanser som fortsatt utvikler seg; For eksempel viser låveugler ikke en konsistent ABR før fire dager etter luke5. Forgjengelige dyr som kyllingluken med nær modne sanser. Utbruddet av hørselen skjer i embryonal utvikling, slik at dager før luke (embryonal dag 21), er hørselssystemet nær funksjonell modning 6,7,8. Altricial fugler og de fleste pattedyrmodeller er utsatt for ekstrinsiske faktorer som påvirker utviklingen og krever husdyrhold til hørselen er moden. Kylling ABRs kan utføres samme dag som luken, og forløper behovet for fôring eller et beriket miljø.
Den embryonale kyllingen har vært en godt studert modell for fysiologi og utvikling, spesielt i den hørbare hjernestammen. Spesifikke strukturer inkluderer kylling cochlea nucleus, delt inn i kjernen magnocellularis (NM) og nucleus angularis (NA), og fuglekorrelasjonen av medial overlegen oliven kjent som nucleus laminaris (NL)6,7. ABR er ideell for å fokusere på sentral auditiv funksjon før nivået av forebrain og cortex. Oversettelse mellom in-vivo ABR-målinger og in-vitro nevronale studier av utvikling8, fysiologi9, tonotopy10 og genetikk11,12 gir ideelle forskningsmuligheter som støtter studier av generell auditiv funksjon.
Selv om ABR har blitt grundig studert i pattedyrmodeller, har det vært mindre fokus for avians. Tidligere fugle ABR-studier inkluderer karakteriseringer av budgerigaren13, hakkespett14, måke15, dykkerfugler16, sebrafink17, daglige raptors18, kanarifugl19, tre arter av ugle 5,20,21,22 og kylling23. Gitt de nesten fire tiårene siden den siste grundige karakteriseringen av kyllingen ABR, har mange av utstyret og teknikkene som tidligere ble brukt endret. Innsikt fra studier i andre fuglemodeller kan bidra til å utvikle moderne kylling ABR-metodikk, samtidig som den fungerer som en sammenligning med kyllingen ABR. Dette papiret vil skissere det eksperimentelle oppsettet og designet for å tillate ABR-opptak i hatchling kyllinger som også kan brukes på embryonale utviklingsstadier og andre små gnager- og fuglemodeller. I tillegg, gitt den forgjengelige utviklingen av kyllingen, kan utviklingsmanipulasjoner utføres uten omfattende husdyrhold. Manipulasjoner til et utviklende embryo kan evalueres bare noen få timer etter at dyret klekker seg med nesten modne hørselsevner.
Fuglens auditive hjernestamme er godt studert, og mange strukturer er analoge med pattedyrets auditive vei. Den hørbare nerven gir eksitatoriske innganger på de to førsteordens sentrale kjernene, cochleakjernen magnocellularis (NM) og angularier (NA). NM sender en eksitatorisk projeksjon bilateralt til sitt auditive mål, nucleus laminaris (NL)7. NL prosjekter til kjernen mesencephalicus lateralis, pars dorsalis (MLd)40,41. NL projiserer også til den overlegne olivary kjernen (SON), som gir tilbakemeldingshemming til NM, NA og NL42. Denne lavere auditive hjernestammemikrociraldrakten er utsøkt bevart for funksjonen den underdaniggjør, lydlokalisering og binaural hørsel33. De øvre hørbare hjernestammeområdene til fuglen har også kjerner analoge med pattedyret lateral lemniscus og dårligere colliculus i midbrain. Gitt disse likhetene, er sammensetningen av fuglen ABR opp til den hørbare midbrain sammenlignbar på tvers av alle vertebrater.
Mens flere fuglearter viser tre positive topper innen 6 ms etter stimulans utbruddet, har korrelasjonen mellom ABR-topper med sentrale auditive strukturer en viss variasjon. Bølge I kan med rimelighet antas å være den første nevrale responsen fra perifer basilar papilla og auditiv nerve og viser liten variasjon blant individer (figur 1C). Etterfølgende bølgeidentifikasjon er mindre sikker og kan variere mellom arter. Kuokkanen et al.17 fastslo nylig at Bølge III av låveuglens ABR genereres av NL; Det er derfor rimelig å argumentere for at Wave II stammer fra NM og NA i cochleakjernen20. Imidlertid ble ugle wave III definert som den positive toppen generert 3 ms etter stimulans utbruddet. Dette tilsvarer Wave II som definert i hatchling kylling ABR. I låveuglen ABR ble bølger I og II kombinert.
Mens klekkekyllingen vanligvis presenteres med tre topper innen 6 ms, ble det av og til observert en fjerde topp (f.eks. se figur 1A). Befolkningsdata, større utvalgsstørrelse og flere eksperimentelle paradigmer ville være nødvendig for å støtte en fjerde bølge, og i noen tilfeller en fem-bølge kylling ABR. Det mest konsistente funnet var de tre topprepresentasjonene som vises her.
Siden ABR er definert som et mål på nevral synkron, kan de viktigste kjernene i den hørbare banen representere hver positive topp i ABR. Signalet som går fra hørselsnerven til NM/NA og deretter til NL kan definere henholdsvis Waves I, II og III i klekkekyllingen ABR. I tillegg kan den senere forekommende fjerde toppen av kyllingen ABR representere en øvre hjernestamme eller midbrain auditiv struktur. Karakteriseringen av fugle ABRs bør også vurdere forskjellen mellom prekociale og altricial fugler. Modningen av hørselsresponser vil variere mellom arter og påvirkes også av andre kritiske trekk som rovdyradferd og/eller vokal læring4. Uansett brukes metodene og teknikkene som er beskrevet lett på en rekke fugle- og virveldyrarter.
Betydningen av å opprettholde dyrekroppstemperaturen er illustrert i figur 2. Etter hvert som den indre kroppstemperaturen gikk ned, økte ventetiden for ABR-responser for samme stimulansintensitetsnivå. Dette er mer uttalt når kroppstemperaturen faller under 32 °C36,37. Den omtrent 1 ms latens økningen i ABR er mindre enn tidligere rapportert i kylling23. Katayama23 brukte imidlertid en 12-dagers gammel klekking som ble avkjølt og deretter oppvarmet over en 4 timers periode. Dataene i figur 2 ble registrert under kjøleprosessen over en periode på 20 minutter. For å oppnå den beste kvaliteten og de mest konsistente opptakene, må dyrets kroppstemperatur opprettholdes, og alle opptak bør gjøres ved samme fysiologiske temperatur blant dyr.
Effekten av alder på ABR er liten, men viktig å vurdere. Mens bare ventetiden til Waves I og II av ABR var betydelig forskjellig, er dette delvis fordi bare tre unge hatchlings ble brukt i figur 3; de tre andre var ikke til stede med tre identifiserbare ABR-topper. ABR-amplitude og terskelforskyvninger kan også være tydelige ved bruk av store utvalgsstørrelser eller sammenligning av frekvensspesifikke ABR-er. Denne aldersrelaterte effekten kan skyldes væske i kyllingens mellomøre. Slike ledende endringer fører til en markert økning i ABR-terskler for både menneskelige og andre pattedyrmodeller38,39.
Ved hjelp av to forskjellige opptaksmontasjer ble lignende svar observert (figur 4A). Mens den vanligste montasjen plasserer referanseelektroden bak stimulansen som mottar øret, kan det være nyttig å ha referanseelektroden i nakkevevet hvis det er kirurgisk inngrep som følger med ABR. Men hvis tokanals ABR-opptak brukes, bør referanseelektrodene plasseres separat og symmetrisk, noe som er vanskelig hvis du plasserer referanseelektroden i nakken. Mastoidposisjonen for referanseelektroden anbefales å standardisere så mange aspekter ved opptak som mulig. Tokanals ABR-opptak er et effektivt verktøy som krever lite ekstra forberedelse og resulterer i lignende svar mellom ørene. Mindre amplitudeforskjeller skyldtes sannsynligvis plasseringen av øretelefonen. Tokanalsopptak gir enkel sammenligning mellom et eksperimentelt manipulert øre eller hjernehalvdel kontra en kontroll. Dette oppsettet vil også være nødvendig for testing av binaurale ABR-er. Fremtidige eksperimenter ved hjelp av kyllingen ABR kan referere til tidligere litteratur om opptakskonfigurasjoner og montasjer34.
Denne metodikken har flere begrensninger. Som nevnt i trinn 5.1, kan dårlig spekulumplassering føre til et 40 dBSPL-skifte som svar. Dette kan føre til feil tolkning av et manipulert eller modifisert dyr. Følgende forholdsregler anbefales: Skaff et stort utvalg av kontrolldata før du anskaffer ABR-ene til manipulerte eller mutante modeller. Ikke reduser stimulusintensiteten med mer enn 20 dBSPL mellom opptakene. Hvis amplituden eller latensen skifter mer enn forventet, kontroller dyret og spekulumposisjonen. Gjenta ABR-stimulansen for å observere endringer. Hvis spekulumet har beveget seg, må du ta tilbake tidligere tester. En annen begrensning er kalibrering av ABRs. Uten riktig kalibrering for å registrere lydtrykknivået, er intensiteten som presenteres for dyret ukjent. Ved måling av lydutgang, bruk samme spekulum som i eksperimentell opptak og en liten mikrofon inne i et hulrom som tilnærmer dyrets ørekanallengde (~ 5 mm). Mål de samme tonefrekvensene som brukes i eksperimenter, da kalibreringer er frekvensspesifikke. Håndboken for både maskinvare- og programvaresystemer kan komme med kalibreringsinstruksjoner. Det er også flere filtre som lineær fase og minimum fase filtre, som kan forbedre klikk og tone burst ABRs43. Disse filtrene ble ikke brukt i den nåværende studien. Ytterligere hensyn, som stigning og falltid for en tone, sprakk spektralkonvolutten som endret seg som en funksjon av frekvens eller endring av stignings- og falltiden for klikkstimuliene ble heller ikke undersøkt. Dette er gode fremtidige undersøkelser når pålitelige og konsistente ABR-er kan anskaffes.
Sammenligningen av hatchling kylling til andre fuglemodeller er lovende. Budgerigars og østlige screech-ugler viser også tre positive mikrovolttopper i løpet av de første 6 ms av ABR13,22. I forskjellige arter av speil blir også tre topper sett, men ventetiden er senere i tide. I tillegg er rekkevidden av beste frekvensfølsomhet i speil mellom 1500 og 4000 Hz, noe som er noe høyere enn kyllingens beste terskel på 1000 Hz. I voksenkyllingen er den beste følsomheten ved 2000 Hz35, så det kan være forbedret hørsel av høye frekvenser når kylling hatchlings utvikler seg til voksne. Denne utviklingen vil variere blant fuglearter, med tanke på dyrets altricial eller forgjengelige utvikling4.
De eksperimentelle metodene som er skissert her, kan bidra til å bestemme hvilke faktorer som fører til skade eller endringer i hørselsresponser og terskler, samt studier på ulike stadier av embryonal utvikling. Genetisk manipulasjon, aldring og støyeksponering er alle kjente manipulasjoner hos dyr og andre fuglemodeller 24,25,44,45. Disse metodene bør utvides til kyllingmodellen nå som teknikker som in-ovo-elektroporasjon tillater uttrykk for proteiner som er fokalt og temporalt kontrollert på den ene siden av den hørbare hjernestammen12,46. Dette tillater direkte sammenligning av ABRs fra det genetisk manipulerte øret til det kontralaterale kontrolløret ved hjelp av et tokanals opptaksparadigme.
Totalt sett er ABR av hatchling kyllinger en nyttig forskningsmetode, nesten identisk med tiltak for hørselsfunksjon i menneskelige og andre pattedyrmodeller. Det er også en ikke-invasiv, in-vivo-metodikk . Bortsett fra bedøvelsesinjeksjon og subdermal elektrodeplassering av noen få millimeter, er det ikke nødvendig med annen fysisk manipulasjon. En hatchling kan teoretisk testes flere ganger i løpet av et utviklingstidsforløp på dager eller uker hvis den holdes i et passende miljø. Denne protokollen legger ikke bare ut de nødvendige trinnene og registreringsparametrene for hatchling kylling ABR, men den foreslår egenskaper ved en fugle ABR som kan informere videre testing i auditiv hjernestammefunksjon.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet støttes av NIH/NIDCD R01 DC017167
1/8 inch B&K Microphone | Brüel & Kjær | 4138 | Type 4138-A-015 also works |
Auditory Evoked Potential Universal Smart Box | Intelligent Hearing Systems | M011110 | |
Custom Sound Isolation Chamber | GK Soundbooth Inc | N/A | Custom built |
DC Power Supply | CSI/Speco | PSV-5 | |
ER3 Insert Earphone | Intelligent Hearing Systems | M015302 | Used as sound transducer |
Euthasol | Virbac | 710101 | Controlled Substance; euthanasia solution |
Insulin Syringe (29 G) | Comfort Point | 26028 | |
Ketamine | Covetrus | 11695-0703-1 | Controlled Substance |
Power Supply | Powervar | 93051-55R | |
Rectal Probe | YSI | 401 (10-09010) | Any 400 series probe will work with the YSI temperatuer monitor |
Subdermal needles | Rhythmlink | RLSND107-1.5 | |
Temperature Monitor | YSI | 73ATA 7651 | Works with any 400 series rectal probe |
Xylazine | Anased | 59399-110-20 | Used with ketamine and water for anesthetic |