Ein TNBS-induziertes Nagetiermodell zur Untersuchung der pathogenen Rolle von mechanischem Stress bei Morbus Crohn
Summary
Das vorliegende Protokoll beschreibt die Entwicklung eines Morbus Crohn-ähnlichen Colitis-Modells bei Nagetieren. Eine transmurale Entzündung führt zu einer Stenose an der TNBS-Instillationsstelle, und eine mechanische Vergrößerung wird im Segment proximal zur Stenose beobachtet. Diese Änderungen ermöglichen die Untersuchung der mechanischen Belastung bei Colitis.
Abstract
Entzündliche Darmerkrankungen (IBD) wie Morbus Crohn (CD) sind chronisch entzündliche Erkrankungen des Magen-Darm-Traktes, von denen etwa 20 pro 1.00.000 in Europa und den USA betroffen sind. CD ist gekennzeichnet durch transmurale Entzündungen, Darmfibrose und Luminalstenose. Obwohl entzündungshemmende Therapien helfen können, Entzündungen zu kontrollieren, haben sie keine Wirksamkeit bei Fibrose und Stenose bei CD. Die Pathogenese der CD ist nicht gut verstanden. Aktuelle Studien konzentrieren sich hauptsächlich auf die Abgrenzung von dysregulierten Immunantwortmechanismen des Darms. Während CD-assoziierte transmurale Entzündungen, Darmfibrose und luminale Stenose alle eine mechanische Belastung der Darmwand darstellen, ist die Rolle der mechanischen Belastung bei CD nicht gut definiert. Um festzustellen, ob mechanischer Stress eine unabhängige pathogene Rolle bei CD spielt, wurde ein Protokoll des TNBS-induzierten CD-ähnlichen Kolitis-Modells bei Nagetieren entwickelt. Dieses TNBS-induzierte transmurale Entzündungs- und Fibrosemodell ähnelt pathologischen Kennzeichen von CD im Dickdarm. Es wird durch intrakolonische Instillation von TNBS in den distalen Dickdarm erwachsener Sprague-Dawley-Ratten induziert. In diesem Modell führt eine transmurale Entzündung zu einer Stenose an der TNBS-Instillationsstelle (Site I). Mechanische Dehnung wird in dem Teil proximal zur Instillationsstelle (Site P) beobachtet, der mechanische Belastung, aber keine sichtbare Entzündung darstellt. Der distale bis zur Entzündung (Punkt D) distale Dickdarmabschnitt stellt weder eine Entzündung noch eine mechanische Belastung dar. Markante Veränderungen der Genexpression, der Immunantwort, der Fibrose und des Wachstums der glatten Muskulatur an verschiedenen Stellen (P, I und D) wurden beobachtet, was einen tiefgreifenden Einfluss mechanischer Belastungen hervorhebt. Daher wird uns dieses Modell der CD-ähnlichen Kolitis helfen, die pathogenen Mechanismen von CD besser zu verstehen, insbesondere die Rolle von mechanischem Stress und mechanischer stressinduzierter Genexpression bei Immundysregulation, Darmfibrose und Gewebeumbau bei CD.
Introduction
Entzündliche Darmerkrankungen (IBD), einschließlich Colitis ulcerosa (UC) und Morbus Crohn (CD), sind durch chronische Entzündungen im Magen-Darm-Trakt (GI) gekennzeichnet. Es betrifft ~ 1-2 Millionen Amerikaner1. Die geschätzten jährlichen Kosten für die IBD-Pflege in den USA belaufen sich auf 11,8 Milliarden US-Dollar. Im Gegensatz zu UC ist die CD durch transmurale Entzündung und Strikturbildung gekennzeichnet 2,3. Strikturbildung (Stenose) tritt bei bis zu 70% der CD-Patientenauf 3 und kann durch transmurale Entzündung (entzündliche Stenose) oder Darmfibrose (fibrotische Stenose) verursacht werden4,5. Darmfibrose ist gekennzeichnet durch übermäßige Kollagenablagerung und andere extrazelluläre Matrizen (ECM) mit glatten Muskelzellen (SMC) als einer der wichtigsten mesenchymalen Zelltypen, die an dem Prozess beteiligtsind 3,4. Die mit Hypertrophie assoziierte Hyperplasie der glatten Muskulatur ist eine weitere signifikante histologische Veränderung der fibrotischen Stenose bei CD6. Obwohl die Strikturbildung bei CD mit chronischen Entzündungen verbunden ist, ist keine entzündungshemmende Behandlung wirksam, außer der chirurgischen Behandlung 2,6. Die rezidivierenden Fälle nach der Operation betragen jedoch fast 100%, wenn genügend Zeitzur Verfügung gestellt wird 2,7. Als Entzündungsreaktion können sich Fibrose und SMC-Hyperplasie auch bei nicht-entzündlichen Zuständen (d.h. Darmverschluss) im Darm entwickeln 8,9; Es wird angenommen, dass sowohl entzündungsabhängige als auch unabhängige Mechanismen an der Strikturbildung beteiligtsind 3,4. Angesichts der Tatsache, dass umfangreiche Forschungen zu den entzündungsabhängigen Mechanismen keine wirksame Therapie für die Strikturbildung geführt haben, sind Studien zur möglichen Rolle entzündungsunabhängiger Mechanismen bei Darmfibrose erforderlich.
Als nicht-entzündlicher Faktor tritt mechanischer Stress (MS) im Zusammenhang mit Ödemen, Infiltration entzündlicher Zellen, Gewebedeformation, Fibrose und Stenose10,11,12,13 häufig bei IBD auf, insbesondere bei CD, die durch transmurale Entzündungen gekennzeichnet ist. Mechanischer Stress ist am bemerkenswertesten bei stenotischer CD, wo Stenose (entzündlich oder fibrotisch) an der Entzündungsstelle mechanische Belastung im lokalen Gewebe darstellt und zu Lumendehnung im Segment proximal zur Obstruktionsstelle führt10,14. Frühere In-vitro-Studien haben gezeigt, dass mechanischer Stress die Genexpression spezifischer Entzündungsmediatoren (d. h. COX-2, IL-6)8,14,15 und Wachstumsfaktoren (d. h. TGF-β) im Magen-Darm-Gewebe, insbesondere der glatten Darmmuskelzellen (SMC)16, verändert. Neuere Studien haben auch gezeigt, dass die Expression spezifischer profibrotischer Mediatoren wie des Bindegewebswachstumsfaktors (CTGF) sehr empfindlich auf mechanische Belastung reagiert17,18. Es wurde die Hypothese aufgestellt, dass mechanischer Stress eine unabhängige pathogene Rolle bei CD-assoziierten Entzündungen, Fibrosen und Gewebeumbauten spielen könnte. Die pathogene Bedeutung von mechanischem Stress bei Darmentzündungen, Fibrosen und Hyperplasie der glatten Muskulatur bei der KV bleibt jedoch weitgehend unerforscht. Dies kann zum Teil daran liegen, dass Entzündungen ein sichtbarerer und besser untersuchter Prozess sind als mechanischer Stress. Noch wichtiger ist, dass es kein klar definiertes Tiermodell von IBD gibt, um die Wirkung von mechanischem Stress von der von Entzündungen zu unterscheiden.
Die aktuelle Arbeit beschreibt ein Nagetiermodell der Morbushuhn-ähnlichen Colitis, die durch intrakolonische Injektion von Hapten Reagenz 2,4,6-Trinitrobenzolsulfonsäure (TNBS) 19,20 induziert wird, das dem Zweck dienen könnte, die Rolle der mechanischen Belastung bei CD zu untersuchen. Es wurde festgestellt, dass die TNBS-Instillation eine lokalisierte (~ 2 cm lange) transmurale Entzündung mit Lumenverengung (Stenose) im distalen Dickdarm induzierte. Die Stenose führt zu einer ausgeprägten Darmdehnung (mechanische Belastung)14,15, aber nicht zu einer sichtbaren Entzündung im Dickdarmsegment proximal zur Instillationsstelle. Im Gegenteil, das zur Stenosestelle distale Dickdarmsegment stellt weder eine Entzündung noch eine mechanische Belastung dar. Signifikante ortsspezifische Veränderungen in der Genexpression, Entzündung, Fibrose und SMC-Hyperplasie wurden an den drei verschiedenen Stellen beobachtet. Die Ergebnisse deuten darauf hin, dass mechanischer Stress, insbesondere die mechanische, stressinduzierte Genexpression, eine entscheidende Rolle bei der Entwicklung von Fibrose und Hyperplasie bei Morbus Crohn Colitis spielen kann.
Protocol
Representative Results
Discussion
TNBS-induzierte Kolitis wurde 1989 eingeführt und wird seit 19,20,23 als experimentelles Modell für Morbus Crohn verwendet. Wesentliche Merkmale dieses Modells bei Nagetieren sind die Entwicklung einer transmuralen Entzündung, die den histopathologischen Läsionen, die bei menschlichem Morbus Crohn entwickelt wurden, sehr ähnlich ist19,20. Frühere Studien zum Modell…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wird zum Teil durch Zuschüsse des NIH (R01 DK124611 bis XZS) und des US-Verteidigungsministeriums (W81XWH-20-1-0681 bis XZS) unterstützt. Die histologische Arbeit wurde mit Hilfe des UTMB Surgical Pathology Lab durchgeführt.
Materials
| ACT-1 Control Software Ver2.63 | Nikon | DXM1200F | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module | BIO-RAD | 1851196 | |
| CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems | BIO-RAD | 1845097 | |
| Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer | Dako | AR310 | |
| Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 | Dako | AR173 | |
| DXM1200 Digital Color HR Camera | Nikon | DXM1200 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | ThermoFisher Scientific | 4352930E | |
| E-Z Anesthesia | E-Z Systems Inc. | EZ-155 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad | 9.0.2 (161) | |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | BIO-RAD | HSP9601 | |
| HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) | CORNING | 21-021-CV | |
| HM 325 Microtome | Thermo Scientific | 23-900-667 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-10 | |
| LI-COR Odyssey Digital Imaging System | LI-COR | 9120 | |
| Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler | Eppendorf | 5341 | |
| Medical grade open end polyurethane catheter | Covidien | 8890703013 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Nikon Eclipse E800 Upright Microscope | Nikon | E800 | |
| Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm | BIO-RAD | 1620215 | |
| Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative | Miralax | C8175 | Dose: 17g in 226 mL of water |
| RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers |
QIAGEN | 74106 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4444557 | |
| Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 | Sakura | 6190 | |
| Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer | Sakura | 6171 | |
| TNBS (Picrylsulfonic acid solution) | SIGMA-ALDRICH | 92822 |
References
- Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn’s disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
- Hwang, J. M., Varma, M. G. Surgery for inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).
- Latella, G., Rieder, F. Intestinal fibrosis: Ready to be reversed. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).
- Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).
- Bettenworth, D., et al. Assessment of Crohn’s disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review. Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).
- Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn’s fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme. Journal of Crohn’s and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).
- Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. Natural course of Crohn’s disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms. Gut. 33 (3), 331-335 (1992).
- Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence. PLoS One. 9, 106242 (2014).
- Gabella, G., Yamey, A. Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine. Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).
- Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease. Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).
- Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
- Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
- Cox, C. S., et al. Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance. Shock. 29 (5), 598-602 (2008).
- Shi, X. Z. Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells. Frontiers in Physiology. 8, 1000 (2017).
- Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).
- Gutierrez, J. A., Perr, H. A. Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).
- Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 5, 24 (2012).
- Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins. The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).
- Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn’s colitis and ulcerative colitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).
- Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).
- Shi, X. Z., Sarna, S. K. Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).
- Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).
- Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Mudter, J., Neurath, M. F. Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance. Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).
- Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders. Frontiers in Pharmacology. 12, 809350 (2021).
