En TNBS-indusert gnagermodell for å studere den patogene rollen som mekanisk stress i Crohns sykdom
Summary
Den nåværende protokollen beskriver utviklingen av en Crohns-lignende kolittmodell hos gnagere. Transmural betennelse fører til stenose på TNBS innåndingssted, og mekanisk utvidelse observeres i segmentet proksimalt til stenose. Disse endringene tillater å studere mekanisk stress i kolitt.
Abstract
Inflammatoriske tarmsykdommer (IBD) som Crohns sykdom (CD) er kroniske inflammatoriske lidelser i mage-tarmkanalen som påvirker omtrent 20 per 100.000 i Europa og USA. CD er preget av transmural betennelse, tarmfibrose og luminal stenose. Selv om antiinflammatoriske terapier kan bidra til å kontrollere betennelse, har de ingen effekt på fibrose og stenose i CD. Patogenesen av CD er ikke godt forstått. Aktuelle studier fokuserer hovedsakelig på avgrensning av dysregulerte tarmimmunitetsmekanismer. Mens CD-assosiert transmural betennelse, intestinal fibrose og luminal stenose alle representerer mekanisk stress til tarmveggen, er rollen som mekanisk stress i CD ikke godt definert. For å avgjøre om mekanisk stress spiller en uavhengig patogen rolle i CD, er det utviklet en protokoll av TNBS-indusert CD-lignende kolittmodell hos gnagere. Denne TNBS-induserte transmurale betennelses- og fibrosemodellen ligner patologiske kjennetegn på CD i tykktarmen. Det er indusert ved intrakolon instillasjon av TNBS i distal kolon av voksne Sprague-Dawley rotter. I denne modellen fører transmural betennelse til stenose på TNBS instillasjonssted (område I). Mekanisk distensjon observeres i den delen som er proksimal til innåndingsstedet (sted P), som representerer mekanisk stress, men ikke synlig betennelse. Den koloniske delen distal til betennelse (område D) presenterer verken betennelse eller mekanisk stress. Karakteristiske endringer av genuttrykk, immunrespons, fibrose og jevn muskelvekst på forskjellige steder (P, I og D) ble observert, og fremhevet en dyp innvirkning av mekanisk stress. Derfor vil denne modellen av CD-lignende kolitt hjelpe oss å bedre forstå CD-ens patogene mekanismer, spesielt rollen som mekanisk stress og mekanisk stressindusert genuttrykk i immundysregulering, tarmfibrose og vevsoppussing i CD.
Introduction
Inflammatorisk tarmsykdom (IBD), inkludert ulcerøs kolitt (UC) og Crohns sykdom (CD), er preget av kronisk betennelse i mage-tarmkanalen (GI). Det påvirker ~ 1-2 millioner amerikanere1. De estimerte årlige kostnadene for IBD-omsorg i USA er 11,8 milliarder dollar. I motsetning til UC er CDen preget av transmural betennelse ogstrenghetsdannelse 2,3. Strikturdannelse (stenose) forekommer hos opptil 70% av CD-pasientene3 og kan være forårsaket av transmural betennelse (inflammatorisk stenose) eller tarmfibrose (fibrotisk stenose)4,5. Intestinal fibrose er preget av overdreven kollagenavsetning og andre ekstracellulære matriser (ECM) med glatte muskelceller (SMC) som en av de viktigste mesenchymale celletypene som er involvert i prosessen 3,4. Glatt muskelhyperplasi assosiert med hypertrofi er en annen signifikant histologisk endring i fibrotisk stenose i CD6. Selv om streng dannelse i CD er forbundet med kronisk betennelse, er ingen antiinflammatorisk behandling effektiv, bortsett fra kirurgisk behandling 2,6. Imidlertid er tilbakefall etter operasjonen nesten 100%, gitt tilstrekkelig tid 2,7. Som en inflammatorisk respons kan fibrose og SMC hyperplasi også utvikle seg i ikke-inflammatoriske forhold (dvs. tarmobstruksjon) i tarmen 8,9; Det antas at både betennelsesavhengige og uavhengige mekanismer er involvert i strenghetsdannelse 3,4. Gitt at omfattende forskning på betennelsesavhengige mekanismer ikke har oversatt til noen effektiv terapi for streng dannelse, er det nødvendig med studier av mulig rolle av betennelsesuavhengige mekanismer i tarmfibrose.
Som en ikke-inflammatorisk faktor oppstår mekanisk stress (MS) forbundet med ødem, inflammatorisk celleinfiltrasjon, vevsdeformasjon, fibrose og stenose 10,11,12,13 ofte i IBD, spesielt CD, som er preget av transmural betennelse. Mekanisk stress er mest bemerkelsesverdig i stenotisk CD, hvor stenose (inflammatorisk eller fibrotisk) i betennelsesstedet presenterer mekanisk stress i det lokale vevet og fører til lumen distention i segmentet proksimalt til hindringsstedet10,14. Tidligere in vitro-studier har vist at mekanisk stress endrer genuttrykket til spesifikke inflammatoriske mediatorer (dvs. COX-2, IL-6)8,14,15 og vekstfaktorer (dvs. TGF-β) i mage-tarmvevet, spesielt tarm glatte muskelceller (SMC)16. Nyere studier fant også at uttrykket av spesifikke pro-fibrotiske mediatorer som bindevevsvekstfaktor (CTGF) er svært følsomt for mekanisk stress17,18. Det ble hypoteset at mekanisk stress kunne spille en uavhengig patogen rolle i CD-assosiert betennelse, fibrose og vevsoppussing. Imidlertid forblir den patogene betydningen av mekanisk stress i tarmbetennelse, fibrose og glatt muskelhyperplasi i CD stort sett uutforsket. Dette kan delvis skyldes at betennelse er en mer synlig og bedre studert prosess enn mekanisk stress. Enda viktigere er at det ikke har vært noen veldefinert dyremodell av IBD for å skille effekten av mekanisk stress fra betennelse.
Det nåværende arbeidet beskriver en gnagermodell av Crohns-lignende kolitt indusert ved intrakolon injeksjon av hapten reagens 2,4,6-trinitrobenzene sulfonic acid (TNBS)19,20, som kan tjene formålet med å studere rollen som mekanisk stress i CD. Det ble funnet at TNBS instillasjon induserte en lokalisert (~ 2 cm lang) transmural betennelse med lumen innsnevring (stenose) i distal kolon. Stenosen fører til markert tarmdistensjon (mekanisk stress)14,15, men ikke synlig betennelse i det koloniske segmentet proksimalt til innåndingsstedet. Tvert imot presenterer kolonsegmentet distalt for stenosestedet verken betennelse eller mekanisk stress. Signifikante stedsspesifikke endringer i genuttrykk, betennelse, fibrose og SMC hyperplasi ble observert på de tre forskjellige stedene. Resultatene tyder på at mekanisk stress, spesielt mekanisk stressindusert genuttrykk, kan spille en kritisk rolle i utviklingen av fibrose og hyperplasi i Crohns kolitt.
Protocol
Representative Results
Discussion
TNBS-indusert kolitt ble introdusert i 1989 og har blitt brukt som en eksperimentell modell av Crohns sykdom siden da 19,20,23. Betydelige trekk ved denne modellen hos gnagere inkluderer utviklingen av en transmural betennelse som ligner på histopatologiske lesjoner utviklet i menneskelig Crohns sykdom19,20. Tidligere studier på modellen har hovedsakelig fokusert på a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet støttes delvis av tilskudd fra NIH (R01 DK124611 til XZS) og det amerikanske forsvarsdepartementet (W81XWH-20-1-0681 til XZS). Histologiarbeidet ble gjort ved hjelp av UTMB Surgical Pathology Lab.
Materials
| ACT-1 Control Software Ver2.63 | Nikon | DXM1200F | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module | BIO-RAD | 1851196 | |
| CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems | BIO-RAD | 1845097 | |
| Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer | Dako | AR310 | |
| Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 | Dako | AR173 | |
| DXM1200 Digital Color HR Camera | Nikon | DXM1200 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | ThermoFisher Scientific | 4352930E | |
| E-Z Anesthesia | E-Z Systems Inc. | EZ-155 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad | 9.0.2 (161) | |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | BIO-RAD | HSP9601 | |
| HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) | CORNING | 21-021-CV | |
| HM 325 Microtome | Thermo Scientific | 23-900-667 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-10 | |
| LI-COR Odyssey Digital Imaging System | LI-COR | 9120 | |
| Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler | Eppendorf | 5341 | |
| Medical grade open end polyurethane catheter | Covidien | 8890703013 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Nikon Eclipse E800 Upright Microscope | Nikon | E800 | |
| Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm | BIO-RAD | 1620215 | |
| Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative | Miralax | C8175 | Dose: 17g in 226 mL of water |
| RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers |
QIAGEN | 74106 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4444557 | |
| Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 | Sakura | 6190 | |
| Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer | Sakura | 6171 | |
| TNBS (Picrylsulfonic acid solution) | SIGMA-ALDRICH | 92822 |
References
- Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn’s disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
- Hwang, J. M., Varma, M. G. Surgery for inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).
- Latella, G., Rieder, F. Intestinal fibrosis: Ready to be reversed. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).
- Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).
- Bettenworth, D., et al. Assessment of Crohn’s disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review. Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).
- Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn’s fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme. Journal of Crohn’s and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).
- Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. Natural course of Crohn’s disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms. Gut. 33 (3), 331-335 (1992).
- Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence. PLoS One. 9, 106242 (2014).
- Gabella, G., Yamey, A. Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine. Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).
- Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease. Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).
- Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
- Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
- Cox, C. S., et al. Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance. Shock. 29 (5), 598-602 (2008).
- Shi, X. Z. Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells. Frontiers in Physiology. 8, 1000 (2017).
- Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).
- Gutierrez, J. A., Perr, H. A. Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).
- Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 5, 24 (2012).
- Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins. The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).
- Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn’s colitis and ulcerative colitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).
- Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).
- Shi, X. Z., Sarna, S. K. Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).
- Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).
- Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Mudter, J., Neurath, M. F. Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance. Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).
- Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders. Frontiers in Pharmacology. 12, 809350 (2021).
