Модель грызунов, индуцированная TNBS, для изучения патогенной роли механического стресса при болезни Крона
Summary
Настоящий протокол описывает развитие модели колита, подобной модели колита Крона, у грызунов. Трансмуральное воспаление приводит к стенозу в месте инстилляции ТНБС, а механическое увеличение наблюдается в сегменте, близком к стенозу. Эти изменения позволяют изучать механические нагрузки при колите.
Abstract
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), такие как болезнь Крона (БК), являются хроническими воспалительными заболеваниями желудочно-кишечного тракта, затрагивающими примерно 20 на 1 000 000 в Европе и США. CD характеризуется трансмуральным воспалением, фиброзом кишечника и люминальным стенозом. Хотя противовоспалительные методы лечения могут помочь контролировать воспаление, они не эффективны при фиброзе и стенозе при БК. Патогенез БК не совсем понятен. Текущие исследования сосредоточены в основном на описании механизмов дисрегулируемого иммунного ответа кишечника. В то время как CD-ассоциированное трансмуральное воспаление, фиброз кишечника и люминальный стеноз представляют собой механическое напряжение для стенки кишечника, роль механического напряжения при CD четко не определена. Чтобы определить, играет ли механическое напряжение независимую патогенную роль в БК, был разработан протокол модели CD-подобного колита, вызванной TNBS, у грызунов. Эта модель трансмурального воспаления и фиброза, вызванная TNBS, напоминает патологические признаки CD в толстой кишке. Он индуцируется интраколонической инстилляцией TNBS в дистальную толстую кишку взрослых крыс Sprague-Dawley. В этой модели трансмуральное воспаление приводит к стенозу в месте инстилляции TNBS (сайт I). Механическое растяжение наблюдается в участке, расположенном ближе к месту инстилляции (участок Р), представляя собой механическое напряжение, но не видимое воспаление. Кишечная часть дистальнее воспаления (участок D) не представляет ни воспаления, ни механического напряжения. Наблюдались отличительные изменения экспрессии генов, иммунного ответа, фиброза и роста гладких мышц на разных участках (P, I и D), что подчеркивает глубокое воздействие механического напряжения. Таким образом, эта модель CD-подобного колита поможет нам лучше понять патогенные механизмы CD, в частности, роль механического стресса и механической экспрессии генов, вызванной стрессом, в иммунной дисрегуляции, кишечном фиброзе и ремоделировании тканей в CD.
Introduction
Воспалительные заболевания кишечника (ВЗК), включая язвенный колит (UC) и болезнь Крона (CD), характеризуются хроническим воспалением в желудочно-кишечном тракте (GI). Он затрагивает ~1-2 миллиона американцев1. Предполагаемые ежегодные расходы на лечение ВЗК в США составляют 11,8 миллиарда долларов. В отличие от UC, CD характеризуется трансмуральным воспалением и стриктурным образованием 2,3. Стриктурное образование (стеноз) встречается у 70% больных БК3 и может быть вызвано трансмуральным воспалением (воспалительный стеноз) или фиброзом кишечника (фиброзным стенозом)4,5. Фиброз кишечника характеризуется чрезмерным отложением коллагена и других внеклеточных матриц (ECM) с гладкомышечными клетками (SMC) как одним из основных типов мезенхимальных клеток, участвующих в процессе 3,4. Гиперплазия гладкой мускулатуры, связанная с гипертрофией, является еще одним значительным гистологическим изменением фиброзного стеноза в CD6. Хотя образование стриктуры при БК связано с хроническим воспалением, никакое противовоспалительное лечение не является эффективным, за исключением хирургического лечения 2,6. Однако послеоперационные рецидивы составляют почти 100%, при наличии достаточного времени 2,7. Как воспалительная реакция, фиброз и гиперплазия SMC могут также развиваться при невоспалительных состояниях (т.е. непроходимости кишечника) в кишечнике 8,9; считается, что в формировании стриктуры участвуют как воспаление зависимые, так и независимые механизмы 3,4. Учитывая, что обширные исследования воспалительных механизмов не привели к какой-либо эффективной терапии образования стриктур, необходимы исследования возможной роли независимых от воспаления механизмов в кишечном фиброзе.
Как невоспалительный фактор, механическое напряжение (РС), связанное с отеком, воспалительной инфильтрацией клеток, деформацией тканей, фиброзом и стенозом 10,11,12,13, обычно встречается при ВЗК, особенно БК, который характеризуется трансмуральным воспалением. Механическое напряжение наиболее примечательно при стенозивном БК, где стеноз (воспалительный или фиброзный) в месте воспаления представляет собой механическое напряжение в местной ткани и приводит к растяжению просвета в сегменте, близком к местуобструкции 10,14. Предыдущие исследования in vitro показали, что механическое напряжение изменяет экспрессию генов специфических медиаторов воспаления (например, ЦОГ-2, IL-6)8,14,15 и факторов роста (т.е. TGF-β) в тканях желудочно-кишечного тракта, особенно в гладкомышечных клетках кишечника (SMC)16. Недавние исследования также показали, что экспрессия специфических профиброзных медиаторов, таких как фактор роста соединительной ткани (CTGF), очень чувствительна к механическому напряжению17,18. Было выдвинуто предположение, что механическое напряжение может играть независимую патогенную роль в CD-ассоциированном воспалении, фиброзе и ремоделировании тканей. Тем не менее, патогенное значение механического стресса при воспалении кишечника, фиброзе и гиперплазии гладких мышц при БК остается в значительной степени неисследованным. Это может быть отчасти потому, что воспаление является более заметным и лучше изученным процессом, чем механическое воздействие. Что еще более важно, не было четко определенной животной модели ВЗК, чтобы отличить эффект механического стресса от эффекта воспаления.
В настоящей работе описана грызуновая модель кроноваподобного колита, индуцированного интраколонизацией гаптен-реагента 2,4,6-тринитробензоловой сульфоновой кислоты (TNBS)19,20, который может служить целью изучения роли механического напряжения в CD. Установлено, что инстилляция ТНБС индуцировала локализованное (~2 см в длину) трансмуральное воспаление с сужением просвета (стенозом) в дистальной части толстой кишки. Стеноз приводит к выраженному растяжению кишечника (механическому напряжению)14,15, но не видимому воспалению в сегменте толстой кишки, близком к месту инстилляции. Напротив, сегмент толстой кишки дистальнее места стеноза не представляет ни воспаления, ни механического напряжения. Значительные сайт-специфические изменения в экспрессии генов, воспаление, фиброз и гиперплазия SMC наблюдались в трех разных участках. Результаты показывают, что механическое напряжение, особенно механическая экспрессия генов, вызванная стрессом, может играть решающую роль в развитии фиброза и гиперплазии при колите Крона.
Protocol
Representative Results
Discussion
TNBS-индуцированный колит был введен в 1989 году и с тех пор используется в качестве экспериментальной модели болезни Крона 19,20,23. Существенные особенности этой модели у грызунов включают развитие трансмурального воспаления, которое очен?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Эта работа частично поддерживается грантами NIH (R01 DK124611 для XZS) и Министерства обороны США (W81XWH-20-1-0681 для XZS). Гистологические работы проводились с помощью Лаборатории хирургической патологии UTMB.
Materials
| ACT-1 Control Software Ver2.63 | Nikon | DXM1200F | |
| C1000 Touch Thermal Cycler with 96-Well Fast Reaction Module | BIO-RAD | 1851196 | |
| CFX96 Optical Reaction Module for Real-Time PCR Systems | BIO-RAD | 1845097 | |
| Dako Agilent Artisan Link Pro Special stainer | Dako | AR310 | |
| Dako-Agilent Masson's Trichrome Kit ref# AR173 | Dako | AR173 | |
| DXM1200 Digital Color HR Camera | Nikon | DXM1200 | |
| Eukaryotic 18S rRNA Endogenous Control | ThermoFisher Scientific | 4352930E | |
| E-Z Anesthesia | E-Z Systems Inc. | EZ-155 | |
| GraphPad Prism 9 | GraphPad | 9.0.2 (161) | |
| Hard-Shell 96-Well PCR Plates, low profile, thin wall, skirted, white/clear | BIO-RAD | HSP9601 | |
| HBSS (Corning Hank's Balanced Salt Solution, 1x without calcium and magnesium) | CORNING | 21-021-CV | |
| HM 325 Microtome | Thermo Scientific | 23-900-667 | |
| Isoflurane | Piramal | NDC 66794-017-10 | |
| LI-COR Odyssey Digital Imaging System | LI-COR | 9120 | |
| Mastercycler epGradient Thermal Cycler with Control Panel 5340 Thermal Cycler | Eppendorf | 5341 | |
| Medical grade open end polyurethane catheter | Covidien | 8890703013 | |
| NanoDrop 2000/2000c Spectrophotometers | Thermo Fisher Scientific | ND2000CLAPTOP | |
| Nikon Eclipse E800 Upright Microscope | Nikon | E800 | |
| Nitrocellulose/Filter Paper Sandwiches Pkg of 50, 0.45 μm, 7 x 8.5 cm | BIO-RAD | 1620215 | |
| Polyethylene Glycol 3350, Osmotic Laxative | Miralax | C8175 | Dose: 17g in 226 mL of water |
| RNeasy Mini Kit (250) 250 RNeasy Mini Spin Columns, Collection Tubes (1.5 mL and 2 mL), RNase-free Reagents and Buffers |
QIAGEN | 74106 | |
| SuperScript III First-Strand Synthesis System | ThermoFisher Scientific | 18080051 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn00573960_g1 CTGF Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Gene Expression Assays Rn99999011_m1 IL6 Probe | ThermoFisher Scientific | 4331182 | |
| TaqMan Fast Advanced Master Mix | ThermoFisher Scientific | 4444557 | |
| Tissue-Tek Prisma H&E Stain Kit #1 | Sakura | 6190 | |
| Tissue-Tek Prisma Plus Automated Slide Stainer | Sakura | 6171 | |
| TNBS (Picrylsulfonic acid solution) | SIGMA-ALDRICH | 92822 |
References
- Kappelman, M. D., et al. The prevalence and geographic distribution of Crohn’s disease and ulcerative colitis in the United States. Clinical Gastroenterology and Hepatology. 5 (12), 1424-1429 (2007).
- Hwang, J. M., Varma, M. G. Surgery for inflammatory bowel disease. World Journal of Gastroenterology. 14 (17), 2678-2690 (2008).
- Latella, G., Rieder, F. Intestinal fibrosis: Ready to be reversed. Current Opinion in Gastroenterology. 33 (4), 239-245 (2017).
- Rieder, F., Fiocchi, C., Rogler, G. Mechanisms, management, and treatment of fibrosis in patients with inflammatory bowel diseases. Gastroenterology. 152 (2), 340-350 (2017).
- Bettenworth, D., et al. Assessment of Crohn’s disease-associated small bowel strictures and fibrosis on cross-sectional imaging: A systematic review. Gut. 68 (6), 1115-1126 (2019).
- Chen, W., Lu, C., Hirota, C., Iacucci, M., Ghosh, S., Gui, X. Smooth muscle hyperplasia/hypertrophy is the most prominent histological change in Crohn’s fibrostenosing bowel strictures: A semiquantitative analysis by using a novel histological grading scheme. Journal of Crohn’s and Colitis. 11 (1), 92-104 (2017).
- Olaison, G., Smedh, K., Sjödahl, R. Natural course of Crohn’s disease after ileocolic resection: Endoscopically visualised ileal ulcers preceding symptoms. Gut. 33 (3), 331-335 (1992).
- Lin, Y. M., Li, F., Shi, X. Z. Mechanical stress is a pro-inflammatory stimulus in the gut: In vitro, in vivo and ex vivo evidence. PLoS One. 9, 106242 (2014).
- Gabella, G., Yamey, A. Synthesis of collagen by smooth muscle in the hyertrophic intestine. Experimental Physiology. 62 (3), 257-264 (1977).
- Katsanos, K. H., Tsianos, V. E., Maliouki, M., Adamidi, M., Vagias, I., Tsianos, E. V. Obstruction and pseudo-obstruction in inflammatory bowel disease. Annals of Gastroenterology. 23 (4), 243-256 (2010).
- Johnson, L. A., et al. Matrix stiffness corresponding to strictured bowel induces a fibrogenic response in human colonic fibroblasts. Inflammatory Bowel Disease. 19 (5), 891-903 (2013).
- Gayer, C. P., Basson, M. D. The effects of mechanical forces on intestinal physiology and pathology. Cell Signalling. 21 (8), 1237-1244 (2009).
- Cox, C. S., et al. Hypertonic saline modulation of intestinal tissue stress and fluid balance. Shock. 29 (5), 598-602 (2008).
- Shi, X. Z. Mechanical regulation of gene expression in gut smooth muscle cells. Frontiers in Physiology. 8, 1000 (2017).
- Shi, X. Z., Lin, Y. M., Powell, D. W., Sarna, S. K. Pathophysiology of motility dysfunction in bowel obstruction: Role of stretch-induced COX-2. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 99-108 (2011).
- Gutierrez, J. A., Perr, H. A. Mechanical stretch modulates TGF-beta1 and alpha1(I) collagen expression in fetal human intestinal smooth muscle cells. American Journal of Physiology. 277 (5), 1074-1080 (1999).
- Lipson, K. E., Wong, C., Teng, Y., Spong, S. CTGF is a central mediator of tissue remodeling and fibrosis and its inhibition can reverse the process of fibrosis. Fibrogenesis Tissue Repair. 5, 24 (2012).
- Chaqour, B., Goppelt-Struebe, M. Mechanical regulation of the Cyr61/CCN1 and CTGF/CCN2 proteins. The FEBS Journal. 273 (16), 3639-3649 (2006).
- Shi, X. Z., Winston, J. H., Sarna, S. K. Differential immune and genetic responses in rat models of Crohn’s colitis and ulcerative colitis. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 300 (1), 41-51 (2011).
- Antoniou, E., et al. The TNBS-induced colitis animal model: An overview. Annals of Medicine and Surgery (London). 11, 9-15 (2016).
- Shi, X. Z., Sarna, S. K. Gene therapy of Cav1.2 channel with VIP and VIP receptor agonists and antagonists: A novel approach to designing promotility and antimotility agents. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 295 (1), 187-196 (2008).
- Lin, Y. M., Sarna, S. K., Shi, X. Z. Prophylactic and therapeutic benefits of COX-2 inhibitor on motility dysfunction in bowel obstruction: Roles of PGE2 and EP receptors. American Journal of Physiology-Gastrointestinal and Liver. 302 (2), 267-275 (2012).
- Morris, G. P., Beck, P. L., Herridge, M. S., Depew, W. T., Szewczuk, M. R., Wallace, J. L. Hapten-induced model of chronic inflammation and ulceration in the rat colon. Gastroenterology. 96 (3), 795-803 (1989).
- Mudter, J., Neurath, M. F. Il-6 signaling in inflammatory bowel disease: Pathophysiological role and clinical relevance. Inflammatory Bowel Disease. 13 (8), 1016-1023 (2007).
- Geesala, R., Lin, Y. M., Zhang, K., Shi, X. Z. Targeting mechano-transcription process as therapeutic intervention in gastrointestinal disorders. Frontiers in Pharmacology. 12, 809350 (2021).
