Méthodes électrophysiologiques pour mesurer les niveaux de photopigment dans les photorécepteurs de la drosophile

Summary

Nous présentons un protocole pour caractériser électrophysiologiquement les photopigments bi-stables : (i) exploiter les déplacements de charge au sein des molécules de photopigment suite à l’absorption des photons et leur énorme quantité dans les photorécepteurs, et (ii) exploiter les différences de spectres d’absorption des états photopigment rhodopsine et métarhodopsine. Ces protocoles sont utiles pour dépister les mutations affectant les systèmes de photopigments stables.

Abstract

La rhodopsine (R) couplée à la photopigment G-protéine de la drosophile est composée d’une protéine (opsine) et d’un chromophore. Le processus d’activation de la rhodopsine est initié par l’isomérisation du chromophore induisant l’absorption des photons, favorisant les changements conformationnels de l’opsine et entraînant un deuxième état photopigment stable et sombre (métarhodopsine, M). L’étude de ce photopigment bi-stable utilisant la mutagénèse aléatoire nécessite des méthodes simples et robustes pour le dépistage des mouches mutantes. Par conséquent, plusieurs méthodes de mesure des réductions des niveaux de photopigment fonctionnel ont été conçues. L’une de ces méthodes exploite les déplacements de charge dans le photopigment après l’absorption des photons et les énormes quantités de molécules de photopigment exprimées dans les photorécepteurs. Ce signal électrique, appelé potentiel récepteur précoce (ou courant récepteur précoce), est mesuré par diverses méthodes électrophysiologiques (par exemple, électrorétinogramme et enregistrements de cellules entières) et est linéairement proportionnel aux niveaux de photopigment fonctionnels. Les avantages de cette méthode sont le rapport signal/bruit élevé, la mesure linéaire directe des niveaux de photopigment et l’indépendance des mécanismes de phototransduction en aval de l’activation de la rhodopsine ou de la métarhodopsine. Une méthode électrophysiologique supplémentaire appelée postpotentiel dépolarisant prolongé (PDA) exploite la bi-stabilité du photopigment de la drosophile et les différences spectrales d’absorption des états pigmentaires R et M des mouches. Le PDA est induit par une lumière bleue intense, convertissant des quantités saturées de rhodopsine en métarhodopsine, ce qui entraîne l’échec de la terminaison de la réponse lumineuse pendant une période prolongée dans l’obscurité, mais il peut être terminé par la conversion de la métarhodopsine en rhodopsine en utilisant une lumière orange intense. Étant donné que le PDA est un signal robuste qui nécessite une conversion massive du photopigment, même de petits défauts dans la biogenèse du photopigment conduisent à un PDA anormal facilement détecté. En effet, des mutants PDA défectueux ont conduit à l’identification de nouvelles protéines de signalisation importantes pour la phototransduction.

Introduction

La rhodopsine (R) activée par la lumière, qui est un récepteur couplé à la protéine G (RCPG), est composée d’une protéine transmembranaire 7 (opsine) et d’un chromophore. Chez Drosophila melanogaster (mouche des fruits), l’absorption des photons induit l’isomérisation du chromophore rétinien 11-cis-3-OH en tout-trans-3-OH-rétinien¹, favorisant le changement conformationnel de la rhodopsine en métarhodopsine (M, Figure 1A). Contrairement à la rhodopsine vertébrée, la fraction prédominante du chromophore invertébré ne se dissocie pas de l’opsine, ce qui entraîne l’état pigmentaire physiologiquement actif et stable à l’obscurité M. À son tour, l’absorption supplémentaire de photons par le chromophore rétinien entièrement trans-3-OH induit l’isomérisation du chromophore ^2,3, générant l’état pigmentaire R avec le chromophore rétinien 11-cis-3-OH. L’état R est un photopigment sombre, stable et physiologiquement non actif. En plus de la voie de régénération des photons extrêmement rapide du chromophore⁴, un peu comme les photopigments des vertébrés, il existe une voie lente enzymatique alternative pour la régénération des chromophores chez les invertébrés, dans laquelle certaines des étapes sont effectuées dans les cellules rétiniennes entourant les cellules photoréceptrices ^5,6.

La drosophile présente de grands avantages en tant qu’organisme modèle pour l’étude des photorécepteurs d’invertébrés. En particulier, l’accessibilité de la préparation et la capacité d’appliquer la génétique moléculaire ont fait de la drosophile un puissant système modèle⁷. Par conséquent, plusieurs méthodes expérimentales in vivo et ex vivo pour étudier la phototransduction en général et les niveaux de photopigment, en particulier, ont été établies. La méthode in vivo la plus simple exploite la réponse de tension extracellulaire relativement grande enregistrée à la lumière de l’œil de la drosophile. En conséquence, la stimulation lumineuse évoque une réponse de tension électrique dans l’ensemble de l’œil qui peut être mesurée à l’aide de l’enregistrement extracellulaire par électrorétinogramme (ERG), qui est ~ 3 ordres de grandeur plus grand que la réponse ERG à la lumière des yeux vertébrés ^8,9. La réponse ERG de la drosophile est robuste et facile à obtenir, ce qui en fait une méthode pratique pour identifier les anomalies de la réponse à la lumière dues aux mutations. La réponse ERG à la lumière provient principalement des photorécepteurs, des cellules pigmentaires (glie) et des neurones secondaires de la lame (voir la figure 1B). Les principaux composants de l’ERG sont (i) la réponse en tension extracellulaire des photorécepteurs, (ii) les transitoires « on » et « off » au début et à la fin du stimulus lumineux qui proviennent des neurones de la lame (Figure 2A, inset, ON, OFF), (iii) la réponse lente des cellules gliales (Figure 2A, encart, flèches), et (iv) la réponse brève et transitoire, résultant d’un déplacement de charge lors de l’activation du photopigment qui précède le transitoire ON¹⁰ (Figure 2C [encart], D, E). Cette réponse brève est composée de deux phases (M1 et M2, Figure 2C [encadré]) et ne peut être induite que par une stimulation lumineuse extrêmement forte, qui active simultanément des millions de molécules de photopigment. Il n’est observé ni sous stimulation bleue (Figure 2D, trace bleue) ni chez les mutants ayant des niveaux de photopigment fortement réduits (Figure 2E, trace rouge), mais son amplitude est légèrement augmentée chez un mutant qui abolit l’activité PLC (Figure 2E, trace orange). La phase M1 est un ERP typique de la mouche résultant de l’activation de M dans les photorécepteurs. La phase M1, qui a une polarité positive (intracellulaire), libère un neurotransmetteur de manière normale dans une synapse inversant les signes et active les neurones de la lame, qui répondent à la dépolarisation des photorécepteurs en générant la phase M2 amplifiée synaptiquement. Ainsi, les phases M1 et M2 reflètent l’activation M^10,11.

La dépolarisation du photorécepteur génère le transitoire « on » cornéen positif, résultant de la synapse d’inversion des signes entre l’axone photorécepteur et les neurones monopolaires de la lame ^10,11 (Figure 1B). La lente montée et la désintégration de l’ERG résultent de la dépolarisation des cellules pigmentaires (Figure 2A, encart, flèches) principalement due à l’efflux K⁺ des cellules photoréceptrices¹² via les canaux ^13,14,15 du potentiel récepteur transitoire (TRP) et TRP-like (TRPL). Ces composants cinétiques lents masquent et déforment en grande partie la forme d’onde de la réponse photoréceptrice par rapport aux enregistrements intracellulaires ou à cellules entières de la réponse photoréceptrice à la lumière ^9,10. De plus, à des éclairements très forts, une réponse transitoire supplémentaire, qui précède et fusionne partiellement avec le transitoire « on », peut être observée (Figure 2C [encart], D,E). Ce signal provient directement de l’activation massive du photopigment¹⁰.

Plusieurs protocoles de régime lumineux utilisant des filtres de densité neutre (ND) et de couleur, ainsi que de forts éclairements, ont été développés pour étudier l’œil en général et la cascade de phototransduction en particulier. Ces protocoles ont également été utilisés pour étudier les propriétés du photopigment.

Le protocole intensité-réponse mesure l’amplitude de crête de la réponse en tension ERG de l’ensemble de l’œil à l’augmentation des intensités lumineuses (Figure 2A, B). Ce protocole aide à détecter les changements dans la sensibilité des cellules photoréceptrices à la lumière⁹.

Le protocole postpotentiel dépolarisant prolongé (PDA) exploite les différences dans les spectres d’absorption de la rhodopsine et de la métarhodopsine qui permet, chez la drosophile, une conversion massive du photopigment de R à son état M intermédiaire physiologiquement actif et stable à l’obscurité². Dans la réponse de tension ERG, une impulsion relativement courte de lumière saturante est donnée et la réponse de tension résultante est enregistrée. Dans cette condition, un plafond (potentiel d’inversion) est atteint par le signal de dépolarisation car l’activation d’une fraction de pourcentage de l’énorme quantité de molécules de rhodopsine (~1 x 10⁸) est suffisante pour atteindre le plafond. La présence des composants de phototransduction en grande abondance garantit que ce plafond sera atteint même chez les mutants avec une réduction significative de la concentration ou un dysfonctionnement subtil des composants de phototransduction. Cette situation empêche l’isolement de ces mutants. Pak et al. ont introduit le dépistage PDA⁷ à la recherche d’un test fiable et révélateur pour isoler les mutants visuels. Chez la drosophile, la réponse PDA est provoquée par l’élimination génétique du pigment de criblage rouge, ce qui permet la conversion du photopigment, et l’application de lumière bleue, qui est préférentiellement absorbée par la rhodopsine (Figure 3A) et, par conséquent, entraîne une conversion nette importante de l’état de photopigment R à M. La terminaison de la phototransduction est perturbée au niveau du photopigment par une conversion nette importante de R en M, ce qui, à son tour, entraîne une excitation soutenue longtemps après l’extinction de la lumière (Figure 2C, Figure 4A [en haut]). Pendant la période PDA, les photorécepteurs sont moins sensibles aux lumières d’essai ultérieures et sont partiellement désensibilisés (inactivés). Le PDA détecte même les défauts mineurs dans la biogenèse de la rhodopsine et teste la capacité maximale de la cellule photoréceptrice à maintenir l’excitation pendant une période prolongée. Comme il dépend strictement de la présence de fortes concentrations de rhodopsine, il obtient facilement des scores pour un réapprovisionnement déficient des composants de phototransduction. Remarquablement, l’écran PDA a donné de nombreux mutants visuels nouveaux et très importants (examinés dans Pak et ^al.7). Ainsi, les mutants PDA isolés par Pak et ^al.7 sont encore extrêmement utiles pour analyser le système visuel de la drosophile .

La PDA est induite chez la drosophile par la saturation de la lumière bleue, ce qui entraîne une dépolarisation continue longtemps après le décalage de la lumière (Figure 4A [en haut]). Après avoir saturé la lumière bleue induisant le PDA, les photorécepteurs périphériques (R1-6) restent continuellement actifs dans l’obscurité à leur capacité maximale, atteignant la saturation. Des lumières bleues saturantes supplémentaires pendant le PDA ne produisent aucune réponse supplémentaire dans les cellules R1-6 pendant de nombreuses secondes, mais induisent une réponse dans les cellules R7-8 qui se superpose au PDA. Les réponses superposées s’expliquent par les différents spectres d’absorption des photopigments exprimés dans ces cellules (R7-8)¹⁶. Le PDA peut être supprimé par la photoconversion de M en R avec une lumière orange saturée (Figure 4A [en haut]). La capacité du PDA à amener les cellules photoréceptrices à leur capacité active maximale, une situation qui ne peut être atteinte par une lumière blanche intense, explique pourquoi il a été un outil majeur pour dépister les mutants visuels de la drosophile. En effet, il permet de détecter même des défauts mineurs dans les protéines impliquées dans la biogenèse des niveaux normaux de photopigment^17,18. Deux groupes de mutants défectueux PDA ont été isolés : ni les mutants inactivation ni les mutants après-potentiel (nina) et les mutants inactivés mais pas les mutants après-potentiels (ina). Le phénotype du premier est l’absence de PDA et l’inactivation associée résultant d’une réduction importante des niveaux de photopigment (Figure 4A [milieu]). Le phénotype de ce dernier montre une inactivation mais pas de dépolarisation sombre après lumière bleue en raison d’un mécanisme encore inconnu chez le mutant avec des niveaux normaux de rhodopsine mais dépourvu de protéines interagissant avec les canaux TRP (Figure 4A [en bas]).

Le PDA résulte de la différence dans la quantité de photopigment par rapport à l’arrestine (ARR2), qui lie et met fin à l’activité M 19,20,21 (Figure 1A). Chez les photorécepteurs de la drosophile, la quantité de photopigment est environ cinq fois plus grande que la quantité d’ARR2¹⁹. Ainsi, les niveaux d’ARR2 sont insuffisants pour inactiver toutes les molécules M générées par une grande photoconversion nette de R à M, laissant un excès de M constamment actif dans l’obscurité 17,19,20,22,23. Ce mécanisme explique l’élimination de la réponse PDA par mutations ou par privation de caroténoïdes^24,25, provoquant une réduction du niveau de photopigment, mais n’affecte pas les niveaux d’arrestine. De plus, cette explication tient également compte des phénotypes de l’allèle²¹ mutant ARR2 nul (arr2³), dans lequel la PDA pourrait être obtenue à des intensités de lumière bleue plus faibles d’environ^{10 fois 19,20,21} (Figure 4B,C). Le PDA n’est pas une caractéristique unique des photorécepteurs de mouches, et il apparaît chez toutes les espèces testées qui ont un M stable sombre avec un spectre d’absorption différent de celui de l’état R, permettant une photoconversion suffisante du photopigment de l’état R à l’état M. Une espèce soigneusement étudiée chez laquelle la phénoménologie PDA a été découverte est le photorécepteur barnacle (Balanus), dans lequel le spectre d’absorption de l’état R est dans une longueur d’onde plus longue que l’état M² (Figure 3B). En conséquence, contrairement à la situation dans la mouche, dans la bernacle, la lumière orange-rouge induit un PDA, tandis que la lumière bleue supprime le PDA².

Le protocole ERP (Early Receptor Potential) exploite le déplacement de charge qui se produit lors de l’activation de R ou M. Le pigment visuel fait partie intégrante de la membrane superficielle du compartiment de signalisation des membranes des vertébrés et des invertébrés³. En conséquence, le processus d’activation dans lequel les molécules de photopigment passent d’un état intermédiaire à l’autre s’accompagne d’un déplacement de charge ^4,26. Comme les molécules de photopigment sont alignées électriquement en parallèle avec la capacité membranaire⁴, un changement conformationnel synchronisé rapide génère un changement de polarisation rapide de la membrane de surface, qui, chez les mouches, se produit dans le compartiment de signalisation composé d’une pile d’environ 30 000 à 50 000 microvillosités appelée rhabdomere. Cette polarisation se décharge ensuite passivement à travers la capacité membranaire du corps cellulaire jusqu’à ce que la membrane cellulaire soit également polarisée. L’ERP est l’enregistrement extracellulaire du déplacement de charge. L’ERP intracellulaire enregistré manifeste l’ERP extracellulaire intégré par la constante de temps de la membrane cellulaire ^4,27,28. Le courant activé par le déplacement de la charge pigmentaire visuelle a également pu être mesuré dans les enregistrements de tension-pince de cellule entière^29,30 (Figure 5A-D), avec l’avantage majeur (dans les enregistrements de courant récepteur précoce (ERC)) de minimiser l’effet de la capacité membranaire sur la cinétique du signal.

La section du protocole décrit comment effectuer des mesures ERG à partir de mesures de l’œil de drosophile ⁹ et des mesures ERC par des enregistrements de cellules entières d’ommatidies isolées de drosophiles ^31,32. Nous décrivons également des protocoles spécifiques qui sont utilisés pour étudier la phototransduction en général et les photopigments en particulier.

Protocol

1. Mesure de la relation intensité-réponse, de l’après-potentiel dépolarisant prolongé (PDA) et du potentiel récepteur précoce (ERP) à l’aide de l’électrorétinogramme Conditions d’élevage appropriées pour la préparation de D. melanogaster Élever les mouches D. melanogaster dans des bouteilles contenant du maïs jaune standard contenant de la nourriture dans un incubateur maintenu à une température de 24 ° C et dans un cycle sombre / clair de 12…

Representative Results

La figure 2 illustre la robustesse et la facilité d’utilisation de la technique ERG. Il est robuste car il est enregistré dans la mouche pratiquement intacte par une technique simple d’enregistrements de tension extracellulaire qui nécessitent une configuration électrophysiologique simple. La robustesse se manifeste par l’obtention d’enregistrements de réponses lumineuses avec des amplitudes relativement grandes (de l’ordre du millivolt) même lorsque les mutations réduisent …

Discussion

Le principal avantage de l’utilisation de la préparation de photorécepteurs de drosophile est son accessibilité, la facilité et la précision de la stimulation lumineuse et, surtout, la capacité d’appliquer la puissance de la génétique moléculaire⁷. Des études génétiques approfondies ont établi la drosophile comme un système modèle extrêmement utile pour la dissection génétique de processus biologiques complexes⁷. La structure relative…

Materials

1 mL syringe with elongated tip			Figure 6M
1 rough tweezers		Dumont #5, Standard	0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 condenser lenses
A/D converter	Molecular Device	Digidata 1200	Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C
Amplifier	Almost perfect electronics		Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D
Anti-vibration Table	Newport	VW-3036-OPT-01	Figure 7H
Capillaries	Harvard Apparatus	Borosilicate glass capillaries	1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)
Clampex	Molecular Device		Software
CO2 tank
Cold light source	Schott	KL1500 LCD	Figure 6C
Delicate wipers	Kimtech		Kimwipes (Figure 6K)
Electrode holder			Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)
Faraday cage	Home made		Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)
Filter (Color)	Schott	OG590, Edge filter	Figure 7S
Filter (Color)	Schott	BP450/40 nm	Figure 7S
Filter (Color)	Blazers	550 nm	Figure 7S
Filter (Color) for cold light source	Schott	RG630	Figure 6C
Filter (Heat)	Schott	KG3	Figure 7S
Filters (Neutral density filter)	Chroma	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	Figure 7S
Flash Lamp system	Honeywell		Figure 7U
Fly sleeper system with injector	Inject + matic		Figure 6A-B
Lamp power supply	PTI	LPS-220	Figure 7W
Light detector	Home made		Phototransistor (Figure 7O)
Light guide			3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)
Light source			High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)
Low temperature melting wax	Home made		Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J)
Magnetic stand for flies	Home made		Figure 6I and Figure 7Q
Microelectrode preamplifier system with head-stage	Almost perfect electronics		Impedance tester (Figure 7G)
Micromanipulator (mechanical coarse)	Tritech Research, Narishige	M-2
Micromanipulator (mechanical fine)	Leitz Microsystems	Leitz Mechanical Micromanipulator	Figure 7F
pCLAMP	Molecular Device		Software
Petri dish			60 mm
Pulse generator	AMPI	Master 8	Figure 7A
Redux cream for electrocardiography	Parker Laboratories	Redux Electrolyte Crème
Shutter driver	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 Single Channel Uni-stable	Figure 7V
Shutter system	Uniblitz, Vincent Associates	LS2 2 mm Uni-stable Shutters	Figure 7V
Silver Wire	Warner Instruments		0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament			0.25 mm diameter (Figure 6F)
Stereoscopic zoom Microscope	Nikon	SMZ-2B	Figure 6D
Stereoscopic zoom Microscope	Wild	Wild M5	With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)
Syringe filters	Millex		22 µm PVDF filter
Vertical pipette puller	Sutter/ Narishige	Model P-97/PP-830	Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)
Wax filament heater	Home made		See figure S1 (Figure 6E-G)
Xenon Flash Lamp system	Dr. Rapp OptoElectronic	JML-C2	Figure 7X