Elektrophysiologische Methoden zur Messung des Photopigmentgehalts in Drosophila-Photorezeptoren

Summary

Wir präsentieren ein Protokoll zur elektrophysiologischen Charakterisierung bistabiler Photopigmente: (i) Ausnutzung der Ladungsverschiebungen innerhalb der Photopigmentmoleküle nach Photonenabsorption und ihrer riesigen Menge in den Photorezeptoren und (ii) Ausnutzung der Absorptionsspektrenunterschiede von Rhodopsin- und Metarhodopsin-Photopigmentzuständen. Diese Protokolle sind nützlich, um nach Mutationen zu suchen, die bistabile Photopigmentsysteme betreffen.

Abstract

Das Drosophila G-Protein-gekoppelte Photopigment Rhodopsin (Beleg) besteht aus einem Protein (Opsin) und einem Chromophor. Der Aktivierungsprozess von Rhodopsin wird durch photonenabsorptionsinduzierende Isomerisierung des Chromophors eingeleitet, die Konformationsänderungen des Opsins fördert und zu einem zweiten dunkelstabilen Photopigmentzustand (Metarhodopsin, M) führt. Die Untersuchung dieses bistabilen Photopigments mittels zufälliger Mutagenese erfordert einfache und robuste Methoden zum Screening mutierter Fliegen. Daher wurden mehrere Methoden zur Messung der Reduktion des funktionellen Photopigmentgehalts entwickelt. Eine solche Methode nutzt die Ladungsverschiebungen innerhalb des Photopigments nach Photonenabsorption und die riesigen Mengen an Photopigmentmolekülen, die in den Photorezeptoren exprimiert werden. Dieses elektrische Signal, das als frühes Rezeptorpotential (oder früher Rezeptorstrom) bezeichnet wird, wird mit einer Vielzahl von elektrophysiologischen Methoden (z. B. Elektroretinogramm- und Ganzzellaufzeichnungen) gemessen und ist linear proportional zum funktionellen Photopigmentspiegel. Die Vorteile dieser Methode sind das hohe Signal-Rausch-Verhältnis, die direkte lineare Messung des Photopigmentgehalts und die Unabhängigkeit der Phototransduktionsmechanismen, die der Rhodopsin- oder Metarhodopsin-Aktivierung nachgeschaltet sind. Eine zusätzliche elektrophysiologische Methode, die als verlängertes Depolarisationsnachpotential (PDA) bezeichnet wird, nutzt die Bistabilität des Drosophila-Photopigments und die absorptionsspektralen Unterschiede der R- und M-Pigmentzustände der Fliege. Der PDA wird durch intensives blaues Licht induziert, das gesättigte Mengen von Rhodopsin in Metarhodopsin umwandelt, was zu einem Versagen der Lichtreaktionsterminierung für eine längere Zeit in der Dunkelheit führt, aber es kann durch Metarhodopsin in Rhodopsin-Umwandlung mit intensivem orangem Licht beendet werden. Da der PDA ein robustes Signal ist, das eine massive Photopigmentumwandlung erfordert, führen selbst kleine Defekte in der Biogenese des Photopigments zu leicht nachweisbarem abnormalem PDA. Tatsächlich führten defekte PDA-Mutanten zur Identifizierung neuartiger Signalproteine, die für die Phototransduktion wichtig sind.

Introduction

Das lichtaktivierte Rhodopsin (Beleg), das ein G-Protein-gekoppelter Rezeptor (GPCR) ist, besteht aus einem 7-Transmembranprotein (Opsin) und einem Chromophor. In Drosophila melanogaster (Fruchtfliege) induziert die Photonenabsorption eine Isomerisierung des 11-cis-3-OH-retinalen Chromophors zu all-trans-3-OH-retinal¹, wodurch die Konformationsänderung des Rhodopsins zu Metarhodopsin gefördert wird (M, Abbildung 1A). Im Gegensatz zu Wirbeltierrhodopsin dissoziiert die vorherrschende Fraktion des wirbellosen Chromophors nicht vom Opsin, was zu dem physiologisch aktiven dunkelstabilen Pigmentzustand M führt. Die zusätzliche Photonenabsorption durch das all-trans-3-OH-retinale Chromophor induziert wiederum eine Isomerisierung des Chromophors ^2,3 und erzeugt den R-Pigmentzustand mit dem 11-cis-3-OH-retinalen Chromophoren. Der R-Zustand ist ein dunkles, stabiles und physiologisch nicht aktives Photopigment. Zusätzlich zu der extrem schnellen Photonenregenerationsroute des Chromophors⁴, ähnlich wie bei Photopigmenten von Wirbeltieren, existiert bei Wirbellosen eine alternative enzymatische langsame Route für die Chromophorregeneration, bei der einige der Stadien in Netzhautzellen durchgeführt werden, die die Photorezeptorzellen umgeben ^5,6.

Drosophila bringt als Modellorganismus für die Untersuchung von Photorezeptoren wirbelloser Tiere große Vorteile mit sich. Insbesondere die Zugänglichkeit des Präparats und die Fähigkeit, molekulare Genetik anzuwenden, haben Drosophila zu einem leistungsfähigen Modellsystem^{gemacht 7}. Daher haben sich mehrere experimentelle In-vivo- und Ex-vivo-Methoden zur Untersuchung der Phototransduktion im Allgemeinen und des Photopigmentgehalts im Besonderen etabliert. Die einfachste In-vivo-Methode nutzt die relativ große extrazellulär aufgezeichnete Spannungsantwort auf Licht des Drosophila-Auges. Dementsprechend ruft die Lichtstimulation eine elektrische Spannungsantwort im gesamten Auge hervor, die mittels extrazellulärer Elektroretinogramm (ERG) -Aufzeichnung gemessen werden kann, die ~ 3 Größenordnungen größer ist als die ERG-Antwort auf Licht von Wirbeltieraugen ^8,9. Die Drosophila ERG-Antwort ist robust und leicht zu erhalten, was sie zu einer bequemen Methode zur Identifizierung von Anomalien in der Lichtreaktion aufgrund von Mutationen macht. Die ERG-Reaktion auf Licht entsteht hauptsächlich von den Photorezeptoren, Pigmentzellen (Gliazellen) und sekundären Neuronen der Lamina (siehe Abbildung 1B). Die Hauptkomponenten des ERG sind (i) die extrazelluläre Spannungsantwort der Photorezeptoren, (ii) die “Ein”- und “Aus”-Transienten am Anfang und Ende des Lichtstimulus, der von den Lamina-Neuronen ausgeht (Abbildung 2A, Inset, ON, OFF), (iii) die langsame Reaktion der Gliazellen (Abbildung 2A, Einschub, Pfeile) und (iv) die kurze und transiente Reaktion, resultierend aus einer Ladungsverschiebung während der Photopigmentaktivierung, die dem ON transienten^{10 vorausgeht} (Abbildung 2C [Einschub], D, E). Diese kurze Reaktion besteht aus zwei Phasen (M1 und M2, Abbildung 2C [Einschub]) und kann nur durch extrem starke Lichtstimulation induziert werden, die gleichzeitig Millionen von Photopigmentmolekülen aktiviert. Es wird weder unter blauer Stimulation (Abbildung 2D, blaue Spur) noch bei Mutanten mit stark reduzierten Photopigmentspiegeln (Abbildung 2E, rote Spur) beobachtet, aber seine Amplitude ist in einer Mutante, die die PLC-Aktivität aufhebt, leicht erhöht (Abbildung 2E, orange Spur). Die M1-Phase ist ein typisches ERP der Fliege, das durch die Aktivierung von M in den Photorezeptoren entsteht. Die M1-Phase, die eine positive Polarität (intrazellulär) aufweist, setzt in einer sign-invertierenden Synapse auf normale Weise einen Neurotransmitter frei und aktiviert die Lamina-Neuronen, die auf die Photorezeptor-Depolarisation reagieren, indem sie die synaptisch verstärkte M2-Phase erzeugen. Somit spiegeln sowohl die M1- als auch die M2-Phase die M-Aktivierung^10,11 wider.

Die Depolarisation des Photorezeptors erzeugt das hornhautpositive “on”-Transienten, das aus der vorzeicheninvertierenden Synapse zwischen dem Photorezeptoraxon und den monopolaren Neuronen der Lamina ^10,11 entsteht (Abbildung ^1B). Der langsame Anstieg und Zerfall des ERG entsteht durch die Depolarisation der Pigmentzellen (Abbildung 2A, Einschub, Pfeile) hauptsächlich durch K⁺-Ausfluss aus den Photorezeptorzellen 12 über das transiente Rezeptorpotential (TRP) und TRP-ähnliche (TRPL) Kanäle^13,14,15. Diese langsamen kinetischen Komponenten maskieren und verzerren weitgehend die Wellenform der Photorezeptorantwort im Vergleich zu intrazellulären oder ganzzelligen Aufzeichnungen der Photorezeptorantwort auf Licht ^9,10. Darüber hinaus kann bei sehr starken Beleuchtungen eine zusätzliche Einschwingreaktion beobachtet werden, die dem “Ein”-Transienten vorausgeht und teilweise mit ihm verschmilzt (Abbildung 2C [Einschub],D,E). Dieses Signal stammt direkt aus der massiven Aktivierung des Photopigments¹⁰.

Mehrere Lichtregimeprotokolle mit neutraler Dichte (ND) und Farbfiltern sowie starken Leuchtblitzen wurden entwickelt, um das Auge im Allgemeinen und die Fototransduktionskaskade im Besonderen zu untersuchen. Diese Protokolle wurden auch verwendet, um die Eigenschaften des Photopigments zu untersuchen.

Das Intensitäts-Antwort-Protokoll misst die Spitzenamplitude der ERG-Spannungsantwort des gesamten Auges auf steigende Lichtintensitäten (Abbildung 2A,B). Dieses Protokoll hilft bei der Erkennung von Veränderungen in der Empfindlichkeit der Photorezeptorzellen gegenüber Licht⁹.

Das PDA-Protokoll (Extended Depolarizing Afterpotential) nutzt die Unterschiede in den Absorptionsspektren von Rhodopsin und Metarhodopsin, die in Drosophila eine massive Photopigmentumwandlung von R in seinen physiologisch aktiven und dunkelstabilen Zwischenzustand M² ermöglichen. In der ERG-Spannungsantwort wird ein relativ kurzer Impuls von sättigendem Licht gegeben, und die resultierende Spannungsantwort wird aufgezeichnet. Unter dieser Bedingung wird durch das Depolarisationssignal eine Obergrenze (Umkehrpotential) erreicht, da die Aktivierung eines Bruchteils eines Prozents der riesigen Menge an Rhodopsinmolekülen (~ 1 x 10⁸) ausreicht, um die Decke zu erreichen. Das Vorhandensein der Phototransduktionskomponenten in großer Fülle stellt sicher, dass diese Decke auch bei Mutanten mit einer signifikanten Verringerung der Konzentration oder einer subtilen Fehlfunktion der Fototransduktionskomponenten erreicht wird. Diese Situation schließt die Isolierung dieser Mutanten aus. Pak et al. führten das PDA-Screening⁷ ein, um einen zuverlässigen und aufschlussreichen Test zur Isolierung visueller Mutanten zu erhalten. Bei Drosophila wird die PDA-Reaktion durch die genetische Entfernung des roten Screening-Pigments, das eine Photopigmentumwandlung ermöglicht, und durch die Anwendung von blauem Licht erreicht, das bevorzugt von Rhodopsin absorbiert wird (Abbildung 3A) und somit zu einer großen Nettoumwandlung des R- in den M-Photopigmentzustand führt. Die Phototransduktionsterminierung wird auf der Ebene des Photopigments durch eine große Nettoumwandlung von R in M gestört, was wiederum zu einer anhaltenden Anregung führt, lange nachdem das Licht ausgeschaltet wurde (Abbildung 2C, Abbildung 4A [oben]). Während der PDA-Periode sind die Photorezeptoren weniger empfindlich gegenüber nachfolgenden Testlichtern und werden teilweise desensibilisiert (inaktiviert). Der PDA erkennt selbst geringfügige Defekte in der Rhodopsin-Biogenese und testet die maximale Kapazität der Photorezeptorzelle, die Erregung über einen längeren Zeitraum aufrechtzuerhalten. Da es streng von der Anwesenheit hoher Konzentrationen von Rhodopsin abhängt, punktet es leicht mit einer mangelhaften Wiederauffüllung der Phototransduktionskomponenten. Bemerkenswerterweise hat der PDA-Bildschirm viele neue und sehr wichtige visuelle Mutanten hervorgebracht (überprüft in Pak et ^al.7). Daher sind die von Pak et ^{al.7 isolierten} PDA-Mutanten immer noch äußerst nützlich für die Analyse des visuellen Systems von Drosophila.

Der PDA wird in Drosophila durch Sättigung von blauem Licht induziert, was zu einer kontinuierlichen Depolarisation lange nach dem Lichtversatz führt (Abbildung 4A [oben]). Nach der Sättigung von PDA-induzierendem blauem Licht bleiben die peripheren Photorezeptoren (R1-6) im Dunkeln mit ihrer maximalen Kapazität kontinuierlich aktiv und erreichen die Sättigung. Zusätzliche sättigende blaue Lichter während des PDA erzeugen für viele Sekunden keine zusätzliche Reaktion in R1-6-Zellen, sondern induzieren eine Reaktion in R7-8-Zellen, die dem PDA überlagert ist. Die überlagerten Reaktionen erklären sich durch die unterschiedlichen Absorptionsspektren der in diesen Zellen exprimierten Photopigmente (R7-8)¹⁶. Der PDA kann durch die Photokonvertierung von M zurück in R mit sättigendem orangefarbenem Licht unterdrückt werden (Abbildung 4A [oben]). Die Fähigkeit des PDA, die Photorezeptorzellen auf ihre maximale aktive Kapazität zu bringen, eine Situation, die durch intensives weißes Licht nicht erreicht werden kann, erklärt, warum es ein wichtiges Werkzeug war, um nach visuellen Mutanten von Drosophila zu suchen. Dies liegt daran, dass es den Nachweis selbst geringfügiger Defekte in Proteinen ermöglicht, die an der Biogenese normaler Photopigmentspiegel^17,18 beteiligt sind. Zwei Gruppen von PDA-defekten Mutanten wurden isoliert: weder Inaktivierungs- noch Afterpotential-Mutanten (Nina-Mutanten) und Inaktivierungs-, aber keine Afterpotential-Mutanten (ina). Der Phänotyp des ersteren ist das Fehlen eines PDA und die damit verbundene Inaktivierung, die sich aus einer starken Verringerung der Photopigmentspiegel ergibt (Abbildung 4A [Mitte]). Der Phänotyp des letzteren zeigt eine Inaktivierung, aber keine dunkle Depolarisation nach blauem Licht aufgrund eines noch unbekannten Mechanismus in der Mutante mit normalen Rhodopsinspiegeln, aber ohne Proteine, die mit den TRP-Kanälen interagieren (Abbildung 4A [unten]).

Der PDA ergibt sich aus der Differenz der Menge an Photopigment im Verhältnis zu Arrestin (ARR2), das die M-Aktivität ^19,20,21 bindet und beendet (Abbildung 1A). Bei Drosophila-Photorezeptoren ist die Menge des Photopigments etwa fünfmal größer als die Menge an ARR2¹⁹. Daher reichen die ARR2-Spiegel nicht aus, um alle M-Moleküle zu inaktivieren, die durch eine große Netto-Photokonversion von R in M erzeugt werden, so dass ein Überschuss an M ständig im Dunkeln aktiv bleibt 17,19,20,22,23. Dieser Mechanismus erklärt die Eliminierung der PDA-Reaktion durch Mutationen oder durch Carotinoid-Entzug^24,25, was zu einer Verringerung des Photopigmentspiegels führt^, aber keinen Einfluss auf den Arrestinspiegel hat. Darüber hinaus berücksichtigt diese Erklärung auch die Phänotypen des Null-ARR2 (arr2³) -Mutantenallels 21, in dem PDA bei ~ 10-fachen Dimmerblaulichtintensitäten 19,20,21 erreicht werden konnte (Abbildung ^4B,C). Der PDA ist kein einzigartiges Merkmal von Fliegen-Photorezeptoren, und er erscheint in jeder getesteten Spezies, die dunkelstabiles M mit einem Absorptionsspektrum hat, das sich von dem des R-Zustands unterscheidet, was eine ausreichende Photokonversion des Photopigments vom R- in den M-Zustand ermöglicht. Eine gründlich untersuchte Spezies, bei der die PDA-Phänomenologie entdeckt wurde, ist der Weißwangen-Photorezeptor (Balanus), bei dem das Absorptionsspektrum des R-Zustands eine längere Wellenlänge als der M-Zustand 2 aufweist (Abbildung 3B^). Dementsprechend induziert orange-rotes Licht im Gegensatz zur Situation in der Fliege im Barnacle einen PDA, während blaues Licht den PDA² unterdrückt.

Das ERP-Protokoll (Early Receptor Potential) nutzt die Ladungsverschiebung, die während der R- oder M-Aktivierung auftritt. Das visuelle Pigment ist ein integraler Bestandteil der Oberflächenmembran des Signalkompartiments von Wirbeltier- und Wirbellosenmembranen³. Dementsprechend wird der Aktivierungsprozess, bei dem die Photopigmentmoleküle von einem Zwischenzustand in den nächsten wechseln, von einer Ladungsverschiebung^{begleitet 4,26}. Da die Photopigmentmoleküle parallel zur Membrankapazität⁴ elektrisch ausgerichtet sind, erzeugt eine schnelle synchronisierte Konformationsänderung eine schnelle Polarisationsänderung der Oberflächenmembran, die bei Fliegen in dem Signalkompartiment auftritt, das aus einem Stapel von ~ 30.000-50.000 Mikrovilli besteht, die Rhabdomere genannt werden. Diese Polarisation entlädt sich dann passiv durch die Membrankapazität des Zellkörpers, bis die Zellmembran gleichmäßig polarisiert ist. Das ERP ist die extrazelluläre Erfassung der Ladungsverschiebung. Das intrazellular aufgezeichnete ERP manifestiert das extrazelluläre ERP, das durch die Zeitkonstante der Zellmembran ^4,27,28 integriert ist. Der durch die visuelle Pigmentladungsverschiebung aktivierte Strom konnte auch in ganzzelligen Spannungsklemmaufzeichnungen^29,30 (Abbildung 5A-D) gemessen werden^, mit dem großen Vorteil (in frühen Rezeptorstromaufzeichnungen (ERC) der Minimierung des Einflusses der Membrankapazität auf die Kinetik des Signals.

Der Protokollabschnitt beschreibt, wie ERG-Messungen von Drosophila-Auge⁹ und ERC-Messungen mit Ganzzellaufzeichnungen von Drosophila-isolierten Ommatidien ^31,32 durchgeführt werden. Wir beschreiben auch spezifische Protokolle, die verwendet werden, um die Phototransduktion im Allgemeinen und Photopigmente im Besonderen zu untersuchen.

Protocol

1. Messung der Intensitätsantwortbeziehung, des verlängerten depolarisierenden Nachpotentials (PDA) und des frühen Rezeptorpotentials (ERP) unter Verwendung des Elektroretinogramms Geeignete Aufzuchtbedingungen für die D. melanogaster Zubereitung Raise D. melanogaster fliegt in Flaschen mit handelsüblichem gelbem Mais, die Lebensmittel enthalten, in einem Inkubator, der bei einer Temperatur von 24 ° C und in einem 12 h Dunkel-/Hellzyklus gehalten wird …

Representative Results

Abbildung 2 veranschaulicht die Robustheit und Benutzerfreundlichkeit der ERG-Technik. Es ist robust, weil es in der praktisch intakten Fliege durch eine einfache Technik der extrazellulären Spannungsaufzeichnung aufgezeichnet wird, die einen einfachen elektrophysiologischen Aufbau erfordern. Die Robustheit manifestiert sich in Aufzeichnungen von Lichtantworten mit relativ großen Amplituden (im Millivoltbereich), auch wenn Mutationen die Lichtantwort stark reduzieren oder verzerren. Daher …

Discussion

Der Hauptvorteil der Verwendung des Drosophila-Photorezeptorpräparats ist seine Zugänglichkeit, die Leichtigkeit und Genauigkeit der Lichtstimulation und vor allem die Fähigkeit, die Kraft der Molekulargenetik anzuwenden⁷. Umfangreiche genetische Studien haben Drosophila als äußerst nützliches Modellsystem für die genetische Dissektion komplexer biologischer Prozesse^{etabliert 7}. Die relativ einfache Struktur des Drosophila-Genoms (bestehend…

Materials

1 mL syringe with elongated tip			Figure 6M
1 rough tweezers		Dumont #5, Standard	0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 condenser lenses
A/D converter	Molecular Device	Digidata 1200	Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C
Amplifier	Almost perfect electronics		Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D
Anti-vibration Table	Newport	VW-3036-OPT-01	Figure 7H
Capillaries	Harvard Apparatus	Borosilicate glass capillaries	1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)
Clampex	Molecular Device		Software
CO2 tank
Cold light source	Schott	KL1500 LCD	Figure 6C
Delicate wipers	Kimtech		Kimwipes (Figure 6K)
Electrode holder			Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)
Faraday cage	Home made		Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)
Filter (Color)	Schott	OG590, Edge filter	Figure 7S
Filter (Color)	Schott	BP450/40 nm	Figure 7S
Filter (Color)	Blazers	550 nm	Figure 7S
Filter (Color) for cold light source	Schott	RG630	Figure 6C
Filter (Heat)	Schott	KG3	Figure 7S
Filters (Neutral density filter)	Chroma	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	Figure 7S
Flash Lamp system	Honeywell		Figure 7U
Fly sleeper system with injector	Inject + matic		Figure 6A-B
Lamp power supply	PTI	LPS-220	Figure 7W
Light detector	Home made		Phototransistor (Figure 7O)
Light guide			3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)
Light source			High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)
Low temperature melting wax	Home made		Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J)
Magnetic stand for flies	Home made		Figure 6I and Figure 7Q
Microelectrode preamplifier system with head-stage	Almost perfect electronics		Impedance tester (Figure 7G)
Micromanipulator (mechanical coarse)	Tritech Research, Narishige	M-2
Micromanipulator (mechanical fine)	Leitz Microsystems	Leitz Mechanical Micromanipulator	Figure 7F
pCLAMP	Molecular Device		Software
Petri dish			60 mm
Pulse generator	AMPI	Master 8	Figure 7A
Redux cream for electrocardiography	Parker Laboratories	Redux Electrolyte Crème
Shutter driver	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 Single Channel Uni-stable	Figure 7V
Shutter system	Uniblitz, Vincent Associates	LS2 2 mm Uni-stable Shutters	Figure 7V
Silver Wire	Warner Instruments		0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament			0.25 mm diameter (Figure 6F)
Stereoscopic zoom Microscope	Nikon	SMZ-2B	Figure 6D
Stereoscopic zoom Microscope	Wild	Wild M5	With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)
Syringe filters	Millex		22 µm PVDF filter
Vertical pipette puller	Sutter/ Narishige	Model P-97/PP-830	Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)
Wax filament heater	Home made		See figure S1 (Figure 6E-G)
Xenon Flash Lamp system	Dr. Rapp OptoElectronic	JML-C2	Figure 7X