שיטות אלקטרופיזיולוגיות למדידת רמות פוטופיגמנט בדרוזופילה פוטורצפטורים

Summary

אנו מציגים פרוטוקול לאפיון אלקטרופיזיולוגי של פוטופיגמנטים דו-יציבים: (1) ניצול תזוזות המטען בתוך מולקולות הפוטוגמנט בעקבות בליעת הפוטונים וכמותם העצומה בפוטורצפטורים, ו-(2) ניצול הבדלי הספיגה-ספקטרום של מצבי הפוטוגמנט של רודופסין ומטרהודופסין. פרוטוקולים אלה שימושיים לסינון מוטציות המשפיעות על מערכות פוטופיגמנט דו-יציבותיות.

Abstract

רודופסין פוטופיגמנט מצומד לחלבון G של דרוזופילה G (R) מורכב מחלבון (אופסין) ומכרומופור. תהליך ההפעלה של רודופסין מתחיל על ידי איזומריזציה הגורמת לספיגת פוטונים של הכרומופור, מקדמת שינויים קונפורמיים של האופסין וגורמת למצב פוטופיגמנט שני יציב כהה (metarhodopsin, M). חקירת פוטופיגמנט דו-יציב זה באמצעות מוטגנזה אקראית דורשת שיטות פשוטות וחזקות לסינון זבובים מוטנטיים. לכן, תוכננו מספר שיטות למדידת הפחתה ברמות הפוטופיגמנט התפקודיות. שיטה אחת כזו מנצלת את תזוזות המטען בתוך הפוטופיגמנט לאחר בליעת הפוטונים ואת הכמויות העצומות של מולקולות הפוטופיגמנט המבוטאות בפוטורצפטורים. אות חשמלי זה, המכונה פוטנציאל הקולטן המוקדם (או זרם הקולטן המוקדם), נמדד על ידי מגוון שיטות אלקטרופיזיולוגיות (למשל, אלקטרורטינוגרמה ורישומי תאים שלמים) והוא פרופורציונלי באופן ליניארי לרמות פוטופיגמנט תפקודיות. היתרונות של שיטה זו הם יחס האות לרעש הגבוה, מדידה ליניארית ישירה של רמות הפוטופיגמנט ועצמאות של מנגנוני פוטו-טרנסדוקציה במורד הזרם להפעלת רודופסין או מטרהודופסין. שיטה אלקטרופיזיולוגית נוספת הנקראת דפולריזציה ממושכת (PDA) מנצלת את היציבות הדו-כיוונית של פוטופיגמנט דרוזופילה ואת ההבדלים הקליטה-ספקטרליים של מצבי פיגמנט R ו-M של זבובים. ה-PDA מושרה על ידי אור כחול עז, הממיר כמויות רוויות של רודופסין למטרהודופסין, וכתוצאה מכך כישלון של סיום תגובת האור למשך זמן ממושך בחושך, אך ניתן לסיים אותו על ידי המרת מטרהודופסין לרודופסין באמצעות אור כתום עז. מכיוון שה-PDA הוא אות חזק שדורש המרת פוטופיגמנט מסיבית, אפילו פגמים קטנים בביוגנזה של הפוטופיגמנט מובילים לזיהוי בקלות של מחשב כף יד חריג. ואכן, מוטציות PDA פגומות הובילו לזיהוי חלבוני איתות חדשניים החשובים לפוטו-טרנסדוקציה.

Introduction

הרודופסין המופעל באמצעות אור (R), שהוא קולטן מצומד לחלבון G (GPCR), מורכב מחלבון 7 טרנס-ממברנה (opsin) וכרומופור. ב-Drosophila melanogaster (זבוב הפירות) ספיגת הפוטונים גורמת לאיזומריזציה של כרומופור הרשתית 11-cis-3-OH ל-all-trans-3-OH-רשתית¹, מה שמקדם את השינוי הקונפורמי של הרודופסין למטרהודופסין (M, איור 1A). שלא כמו רודופסין של בעלי חוליות, החלק השולט של כרומופור חסרי חוליות אינו מתנתק מהאופסין, וכתוצאה מכך מצב הפיגמנט הכהה-יציב הפעיל מבחינה פיזיולוגית M. בתורו, ספיגת פוטון נוספת על ידי כרומופור הרשתית all-trans-3-OH גורמת לאיזומריזציה של הכרומופור ^2,3, ויוצרת את מצב הפיגמנט R עם כרומופור הרשתית 11-cis-3-OH. מצב R הוא פוטופיגמנט כהה, יציב ולא פעיל מבחינה פיזיולוגית. בנוסף לנתיב התחדשות הפוטונים המהיר ביותר של הכרומופור⁴, בדומה לפוטופיגמנטים של בעלי חוליות, קיים מסלול איטי אנזימטי חלופי להתחדשות כרומופורים אצל חסרי חוליות, שבו חלק מהשלבים מבוצעים בתאי רשתית המקיפים את תאי הפוטורצפטורים ^5,6.

דרוזופילה טומנת בחובה יתרונות גדולים כאורגניזם מודל לחקר פוטורצפטורים חסרי חוליות. בפרט, הנגישות של ההכנה והיכולת ליישם גנטיקה מולקולרית הפכו את Drosophila למערכת מודל חזקה⁷. לפיכך, נקבעו מספר שיטות ניסיוניות in vivo ו– ex vivo לחקר פוטו-טרנסדוקציה בכלל ורמות פוטופיגמנט, בפרט. שיטת in-vivo הפשוטה ביותר מנצלת את תגובת המתח החוץ-תאית הגדולה יחסית שנרשמה לאור של עין דרוזופילה. בהתאם לכך, גירוי האור מעורר תגובת מתח חשמלית בעין כולה שניתן למדוד באמצעות הקלטת אלקטרורטינוגרמה חוץ-תאית (ERG), הגדולה בכ-3 סדרי גודל מתגובת ה-ERG לאור של עיניים של בעלי חוליות ^8,9. תגובת Drosophila ERG חזקה ומתקבלת בקלות, מה שהופך אותה לשיטה נוחה לזיהוי חריגות בתגובת האור עקב מוטציות. תגובת ה-ERG לאור נובעת בעיקר מהפוטורצפטורים, מתאי הפיגמנט (גליה) ומהנוירונים המשניים של הלמינה (ראו איור 1B). המרכיבים העיקריים של ה-ERG הם (i) תגובת המתח החוץ-תאית של הפוטורצפטורים, (ii) החולפים “on” ו-“off” בתחילתו ובסיומו של גירוי האור הנובעים מתאי העצב של הלמינה (איור 2A, inset, ON, OFF), (iii) התגובה האיטית של תאי הגליה (איור 2A, inset, חצים), ו-(iv) התגובה הקצרה והחולפת, כתוצאה מתזוזת מטען במהלך הפעלת פוטופיגמנט שקדמה ל-ON ארעי¹⁰ (איור 2C [inset], D, E). תגובה קצרה זו מורכבת משני שלבים (M1 ו-M2, איור 2C [inset]) וניתן להשרות אותה רק על ידי גירוי אור חזק במיוחד, שמפעיל בו-זמנית מיליוני מולקולות פוטופיגמנט. הוא לא נצפה תחת גירוי כחול (איור 2D, עקבות כחולים) וגם לא אצל מוטנטים עם רמות פוטופיגמנט מופחתות מאוד (איור 2E, עקבות אדומים), אבל המשרעת שלו משופרת מעט במוטציה שמבטלת את פעילות ה-PLC (איור 2E, עקבות כתומים). שלב M1 הוא ERP טיפוסי של הזבוב הנובע מהפעלת M בפוטורצפטורים. פאזת M1, שיש לה קוטביות חיובית (תוך תאית), משחררת מוליך עצבי בדרך הרגילה בסינפסה הפוכה של סימנים ומפעילה את נוירוני הלמינה, המגיבים לדה-פולריזציה של פוטורצפטור על ידי יצירת שלב M2 המוגברת מבחינה סינפטית. לפיכך, הן שלב M1 והן שלב M2 משקפים הפעלת M^10,11.

הדה-פולריזציה של הפוטורצפטור יוצרת את ה-“on” החצי-חיובי-חיובי של הקרנית, הנובעת מהסינפסה ההפוכה בין האקסון הפוטורצפטור לבין הנוירונים המונופולריים של הלמינה^10,11 (איור 1B). העלייה האיטית והדעיכה של ה-ERG נובעות מדה-פולריזציה של תאי הפיגמנט (איור 2A, אינסט, חצים) בעיקר כתוצאה משטף K⁺ מתאי הפוטורצפטור¹² דרך פוטנציאל הקולטן הארעי (TRP) ותעלות דמויות TRP (TRPL) 13,14,15. רכיבים קינטיים איטיים אלה מסתירים ומעוותים במידה רבה את צורת הגל של תגובת הפוטורצפטור בהשוואה להקלטות תוך-תאיות או של תאים שלמים של תגובת הפוטורצפטור לאור ^9,10. בנוסף, בהארות חזקות מאוד, ניתן לראות תגובה חולפת נוספת, שקדמה ומתמזגת באופן חלקי עם הארעי “on”, (איור 2C [inset],D,E). אות זה מקורו ישירות בהפעלה המסיבית של הפוטופיגמנט¹⁰.

מספר פרוטוקולים של משטר אור באמצעות צפיפות ניטרלית (ND) ומסנני צבע, כמו גם הבזקי תאורה חזקים, פותחו כדי לחקור את העין בכלל ואת מפל הפוטו-טרנסדוקציה בפרט. פרוטוקולים אלה שימשו גם כדי לחקור את המאפיינים של הפוטוגמנט.

פרוטוקול תגובת העוצמה מודד את משרעת השיא של תגובת מתח ה-ERG של העין כולה לעוצמות אור הולכות וגדלות (איור 2A,B). פרוטוקול זה מסייע באיתור שינויים ברגישות של תאי הפוטורצפטור לאור⁹.

פרוטוקול האפטר-פוטנטי הממושך של דה-פולריזציה (PDA) מנצל את ההבדלים בספקטרום הספיגה של רודופסין ומטרהודופסין המאפשר, בדרוזופילה, המרה פוטופית מסיבית של R למצב M הבינוני הפעיל מבחינה פיזיולוגית והיציב-כהה שלו². בתגובת המתח ERG ניתנת פעימה קצרה יחסית של אור רווי, ותגובת המתח המתקבלת נרשמת. בתנאי זה, תקרה (פוטנציאל היפוך) מושגת על ידי אות הדפולריזציה מכיוון שהפעלת שבריר אחוז מהכמות העצומה של מולקולות רודופסין (~1 x 10⁸) מספיקה כדי להגיע לתקרה. נוכחותם של רכיבי הפוטו-טרנסדוקציה בשפע רב מבטיחה כי תקרה זו תושג גם אצל מוטנטים עם ירידה משמעותית בריכוז או תקלה עדינה ברכיבי הפוטו-טרנסדוקציה. מצב זה מונע את בידודם של מוטנטים אלה. Pak et al. הציגו את בדיקת ה-PDA⁷ בחיפוש אחר בדיקה אמינה וחושפנית לבידוד מוטנטים חזותיים. בדרוזופילה, תגובת ה-PDA נגרמת על ידי הסרה גנטית של פיגמנט ההקרנה האדום, המאפשר המרת פוטופיגמנט, ויישום של אור כחול, אשר נספג באופן מועדף על ידי רודופסין (איור 3A), ובכך מביא להמרה נטו גדולה של ה-R למצב הפוטופיגמנט M. סיום הפוטו-טרנסדוקציה משובש ברמת הפוטופיגמנט על-ידי המרה נטו גדולה של R ל-M, שבתורה גורמת לעירור מתמשך הרבה אחרי שהאור כבוי (איור 2C, איור 4A [למעלה]). במהלך תקופת ה-PDA, הפוטורצפטורים רגישים פחות לנורות הבדיקה הבאות והם חסרי רגישות חלקית (ללא פעילות). ה-PDA מזהה אפילו פגמים קלים בביוגנזה של רודופסין ובודק את הקיבולת המקסימלית של תא הפוטורצפטור כדי לשמור על עירור למשך תקופה ממושכת. מאז זה תלוי לחלוטין בנוכחות של ריכוזים גבוהים של רודופסין, זה בקלות ציונים עבור חידוש לקוי של רכיבי phototransduction. למרבה הפלא, מסך ה-PDA הניב הרבה מוטנטים חזותיים חדשים וחשובים מאוד (שנסקרו ב-Pak et ^al.7). לפיכך, מוטציות ה-PDA שבודדו על ידי Pak et ^al.7 עדיין שימושיות ביותר לניתוח מערכת הראייה של דרוזופילה .

ה-PDA מושרה בדרוזופילה על-ידי הרוויה של אור כחול, וכתוצאה מכך נוצרת דה-פולריזציה רציפה זמן רב לאחר היסט האור (איור 4A [למעלה]). לאחר רוויית האור הכחול הגורם ל-PDA, הפוטורצפטורים ההיקפיים (R1-6) נשארים פעילים ברציפות בחושך בקיבולת המרבית שלהם, ומגיעים לרוויה. אורות כחולים רוויים נוספים במהלך ה-PDA אינם מייצרים תגובה נוספת בתאי R1-6 למשך שניות רבות, אלא גורמים לתגובה בתאי R7-8 שמונחת על גבי ה-PDA. התגובות העל-טבעיות מוסברות על ידי ספקטרום הספיגה השונה של הפוטופיגמנטים המתבטאים בתאים אלה (R7-8)¹⁶. ניתן להדחיק את ה-PDA על-ידי היפוך פוטו-קונטקסט של M בחזרה ל-R עם אור כתום רווי (איור 4A [למעלה]). היכולת של ה-PDA להביא את תאי הפוטורצפטור ליכולת הפעילה המקסימלית שלהם, מצב שלא ניתן להשיג על ידי אור לבן עז, מסבירה מדוע הוא היה כלי מרכזי לסינון מוטציות חזותיות של דרוזופילה. הסיבה לכך היא שהיא מאפשרת זיהוי של אפילו פגמים קלים בחלבונים המעורבים בביוגנזה של רמות פוטופיגמנט תקינות ^17,18. שתי קבוצות של מוטנטים פגומים ב-PDA בודדו: לא מוטנטים של אי-פעילות ולא מוטנטים של אפטר-פוטנטים (נינה) והשבתה, אך לא מוטנטים אפטר-פוטנטיים (ina). הפנוטיפ של הראשון הוא היעדר PDA וההשבתה הנלווית הנובעת מירידה גדולה ברמות הפוטופיגמנט (איור 4A [באמצע]). הפנוטיפ של האחרון מראה חוסר פעילות אך אין דה-פולריזציה כהה לאחר אור כחול עקב מנגנון שעדיין לא ידוע במוטציה עם רמות רודופסין נורמליות אך חסרים חלבונים המקיימים אינטראקציה עם תעלות ה-TRP (איור 4A [למטה]).

ה-PDA נובע מההבדל בכמות הפוטופיגמנט ביחס לעצרין (ARR2), אשר קושר ומסיים פעילות M ^19,20,21 (איור 1A). בפוטורצפטורים של דרוזופילה, כמות הפוטופיגמנט גדולה בערך פי חמישה מכמות ARR2¹⁹. לפיכך, רמות ARR2 אינן מספיקות כדי להשבית את כל מולקולות ה-M הנוצרות על ידי פוטו-קונברסיה נטו גדולה של R ל-M, מה שמשאיר עודף של M פעיל כל הזמן בחושך 17,19,20,22,23. מנגנון זה מסביר את חיסול תגובת ה-PDA על ידי מוטציות או על ידי מניעת קרוטנואידים^24,25, מה שגורם לירידה ברמת הפוטוגמנט, אך אינו משפיע על רמות העצורים. יתר על כן, הסבר זה מסביר גם את הפנוטיפים של אלל מוטנטי ריק ARR2 (arr2³)²¹, שבו ניתן להשיג PDA בעוצמות אור כחול עמום פי 10 בערך 19,20,21 (איור 4B,C). ה-PDA אינו מאפיין ייחודי של פוטורצפטורים של זבובים, והוא מופיע בכל מין שנבדק שיש לו M יציב כהה עם ספקטרום בליעה שונה מזה של מצב R, מה שמאפשר היפוך פוטו-קונסטרוקטיבי מספיק של הפוטופיגמנט ממצב R למצב M. מין שנחקר ביסודיות ובו התגלתה הפנומנולוגיה של ה-PDA הוא הפוטורצפטור הברנקלי (Balanus), שבו ספקטרום הבליעה של מצב R נמצא באורך גל ארוך יותר ממצב M² (איור 3B). לפיכך, בניגוד למצב בזבוב, בברנקל, אור כתום-אדום גורם ל-PDA, בעוד שאור כחול מדכא את ה-PDA².

פרוטוקול פוטנציאל הקולטן המוקדם (ERP) מנצל את תזוזת המטען המתרחשת במהלך הפעלת R או M. הפיגמנט הראייתי הוא חלק בלתי נפרד מממברנת פני השטח של תא האיתות של ממברנות בעלי החוליות וחסרי החוליות³. בהתאם לכך, תהליך ההפעלה שבו מולקולות הפוטופיגמנט משתנות ממצב ביניים אחד למשנהו מלווה בתזוזת מטען ^4,26. מכיוון שמולקולות הפוטופיגמנט מיושרות חשמלית במקביל לקיבוליות הממברנה⁴, שינוי קונפורמציה מסונכרן מהיר יוצר שינוי קיטוב מהיר של קרום פני השטח, אשר, בזבובים, מתרחש בתא האיתות המורכב מערימה של כ-30,000-50,000 מיקרו-וילי הנקראת rhabdomere. קיטוב זה פורק באופן פסיבי דרך קיבוליות הממברנה של גוף התא עד שקרום התא מקוטב באותה מידה. ה- ERP הוא ההקלטה החוץ-סלולרית של תזוזת המטען. ה-ERP המתועד באופן תוך-תאי מבטא את ה-ERP החוץ-תאי המשולב בקבוע הזמן של קרום התא ^4,27,28. את הזרם המופעל על ידי תזוזת מטען הפיגמנט הראייתי ניתן למדוד גם בהקלטות של מהדק מתח של תאים שלמים^29,30 (איור 5A-D), עם היתרון העיקרי (בהקלטות זרם קולטן מוקדם (ERC) של מזעור ההשפעה של קיבוליות הממברנה על הקינטיקה של האות.

פרק הפרוטוקול מתאר כיצד לבצע מדידות ERG ממדידות עין⁹ ו-ERC של דרוזופילה על ידי הקלטות של תאים שלמים מדרוזופילה מבודדת אומטידיה^31,32. אנו מתארים גם פרוטוקולים ספציפיים המשמשים לחקר פוטו-טרנסדוקציה בכלל ופוטופיגמנטים בפרט.

Protocol

1. מדידת הקשר בין תגובת העוצמה, דה-פולריזציה ממושכת של האפטרפוטנציאל (PDA) ופוטנציאל הקולטן המוקדם (ERP) באמצעות האלקטרורטינוגרמה תנאי גידול מתאימים להכנת ד. מלנוגסטר העלאת זבובים D. melanogaster בבקבוקים המכילים תירס צהוב סטנדרטי המכיל מזון באינקובטור המתוחזק בטמפרטור…

Representative Results

איור 2 מדגים את החוסן והקלות של השימוש בטכניקת ERG. הוא חזק משום שהוא נרשם בזבוב הכמעט שלם על ידי טכניקה פשוטה של הקלטות מתח חוץ-תאיות הדורשות מערך אלקטרופיזיולוגי פשוט. החוסן מתבטא בהשגת הקלטות של תגובות אור עם משרעת גדולה יחסית (בטווח המיליוולט) גם כאשר מוטציות מפחיתות או מ?…

Discussion

היתרון העיקרי של שימוש בהכנת הפוטורצפטור של Drosophila הוא הנגישות שלו, הקלות והדיוק של גירוי האור, והכי חשוב, היכולת ליישם את העוצמה של הגנטיקה המולקולרית⁷. מחקרים גנטיים נרחבים ביססו את Drosophila כמערכת מודל שימושית ביותר לניתוח גנטי של תהליכים ביולוגיים מורכבים^7…

Materials

1 mL syringe with elongated tip			Figure 6M
1 rough tweezers		Dumont #5, Standard	0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 condenser lenses
A/D converter	Molecular Device	Digidata 1200	Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C
Amplifier	Almost perfect electronics		Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D
Anti-vibration Table	Newport	VW-3036-OPT-01	Figure 7H
Capillaries	Harvard Apparatus	Borosilicate glass capillaries	1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)
Clampex	Molecular Device		Software
CO2 tank
Cold light source	Schott	KL1500 LCD	Figure 6C
Delicate wipers	Kimtech		Kimwipes (Figure 6K)
Electrode holder			Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)
Faraday cage	Home made		Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)
Filter (Color)	Schott	OG590, Edge filter	Figure 7S
Filter (Color)	Schott	BP450/40 nm	Figure 7S
Filter (Color)	Blazers	550 nm	Figure 7S
Filter (Color) for cold light source	Schott	RG630	Figure 6C
Filter (Heat)	Schott	KG3	Figure 7S
Filters (Neutral density filter)	Chroma	6,5,4,3,2,1,0.5,0.3	Figure 7S
Flash Lamp system	Honeywell		Figure 7U
Fly sleeper system with injector	Inject + matic		Figure 6A-B
Lamp power supply	PTI	LPS-220	Figure 7W
Light detector	Home made		Phototransistor (Figure 7O)
Light guide			3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)
Light source			High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)
Low temperature melting wax	Home made		Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J)
Magnetic stand for flies	Home made		Figure 6I and Figure 7Q
Microelectrode preamplifier system with head-stage	Almost perfect electronics		Impedance tester (Figure 7G)
Micromanipulator (mechanical coarse)	Tritech Research, Narishige	M-2
Micromanipulator (mechanical fine)	Leitz Microsystems	Leitz Mechanical Micromanipulator	Figure 7F
pCLAMP	Molecular Device		Software
Petri dish			60 mm
Pulse generator	AMPI	Master 8	Figure 7A
Redux cream for electrocardiography	Parker Laboratories	Redux Electrolyte Crème
Shutter driver	Uniblitz, Vincent Associates	VCM-D1 Single Channel Uni-stable	Figure 7V
Shutter system	Uniblitz, Vincent Associates	LS2 2 mm Uni-stable Shutters	Figure 7V
Silver Wire	Warner Instruments		0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament			0.25 mm diameter (Figure 6F)
Stereoscopic zoom Microscope	Nikon	SMZ-2B	Figure 6D
Stereoscopic zoom Microscope	Wild	Wild M5	With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)
Syringe filters	Millex		22 µm PVDF filter
Vertical pipette puller	Sutter/ Narishige	Model P-97/PP-830	Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)
Wax filament heater	Home made		See figure S1 (Figure 6E-G)
Xenon Flash Lamp system	Dr. Rapp OptoElectronic	JML-C2	Figure 7X