초파리 광수용체에서 광안료 수준을 측정하기 위한 전기생리학적 방법
Summary
우리는 전기생리학적으로 이중 안정한 광안료를 특성화하기 위한 프로토콜을 제시한다: (i) 광자-흡수 및 광수용체에서의 그들의 엄청난 양에 뒤따르는 광안료 분자 내의 전하 변위를 이용하고, (ii) 로돕신과 메타로돕신 광안료 상태의 흡수-스펙트럼 차이를 이용한다. 이들 프로토콜은 이중-안정한 광안료 시스템에 영향을 미치는 돌연변이를 스크리닝하는데 유용하다.
Abstract
초 파리 G-단백질-결합된 광색소 로돕신(등록상표)은 단백질(opsin)과 발색단으로 구성된다. 로돕신의 활성화 과정은 발색단의 광자 흡수 유도 이성체화에 의해 개시되고, 옵신의 형태적 변화를 촉진하고, 두 번째 어두운 안정한 광안료 상태(metarhodopsin, M)를 초래한다. 무작위 돌연변이 유발을 사용하여 이러한 이중안정한 광안료를 조사하려면 돌연변이 파리를 스크리닝하기 위한 간단하고 강력한 방법이 필요하다. 따라서, 기능성 광안료 수준의 감소를 측정하기 위한 몇몇 방법들이 설계되었다. 그러한 방법 중 하나는 광자 흡수 및 광수용체에서 발현되는 엄청난 양의 광안료 분자에 따른 광안료 내의 전하 변위를 이용한다. 초기 수용체 전위(또는 초기 수용체 전류)로 명명된 이 전기 신호는 다양한 전기생리학적 방법(예를 들어, 일렉트로레티노그램 및 전체 세포 기록)에 의해 측정되며, 기능적 광안료 수준에 선형적으로 비례한다. 이 방법의 장점은 높은 신호 대 잡음비, 광안료 수준의 직접 선형 측정, 로돕신 또는 메타로돕신 활성화에 대한 하류의 광전달 메커니즘의 독립성이다. 장기간 탈분극 후전위(PDA)라고 불리는 추가적인 전기생리학적 방법은 초파리 광안료의 이중 안정성과 플라이 R 및 M 안료 상태의 흡수-스펙트럼 차이를 이용한다. PDA는 강렬한 청색광에 의해 유도되어 포화 된 양의 로돕신을 메타 로돕신으로 변환하여 어둠 속에서 오랜 시간 동안 광 반응 종료가 실패하지만 강렬한 오렌지 빛을 사용하여 메타 로돕신에서 로돕신 변환으로 종료 될 수 있습니다. PDA는 방대한 광안료 전환을 필요로 하는 강력한 신호이기 때문에, 광안료의 생물발생에 있어서 작은 결함이라도 비정상적 PDA를 쉽게 검출할 수 있다. 실제로, 결함 있는 PDA 돌연변이체는 광형질도입에 중요한 신규한 신호전달 단백질의 동정을 이끌었다.
Introduction
G-단백질 결합 수용체(GPCR)인 광활성화 로돕신(R)은 7개의 막횡단 단백질(opsin)과 발색단으로 구성된다. 초파리 멜라노가스터(fruit fly)에서, 광자 흡수는 11-시스-3-OH-망막 발색단의 모든 트랜스-3-OH-망막1에 대한 이성체화를 유도하여, 로돕신의 메타로돕신으로의 형태적 변화를 촉진한다(M, 도 1A). 척추동물 로돕신과는 달리, 무척추동물 발색단의 우세한 분획은 옵신으로부터 해리되지 않으며, 생리활성 암-안정한 색소 상태 M을 초래한다. 차례로, 모든 트랜스-3-OH-망막 발색단에 의한 추가적인 광자 흡수는 발색단2,3의 이성체화를 유도하여, 11-시스–3-OH-망막 발색단과 함께 R 안료 상태를 생성한다. R 상태는 어둡고, 안정하고, 생리학적으로 비활성 광안료이다. 척추동물 광색소와 마찬가지로 발색단4의 매우 빠른 광자 재생 경로 외에도, 발색단 재생을 위한 대안적인 효소적 느린 경로가 무척추동물에 존재하며, 이 경로에서 일부 단계는 광수용체 세포(5,6)를 둘러싸고 있는 망막 세포에서 수행된다.
초파리는 무척추 동물 광수용체를 연구하기위한 모델 유기체로서 큰 이점을 수반합니다. 특히, 제제의 접근성과 분자 유전학을 적용 할 수있는 능력은 초파리를 강력한 모델 시스템7로 만들었습니다. 따라서, 일반적으로 광형질도입 및 광안료 수준을 연구하기 위한 몇 가지 생체내 및 생체외 실험 방법, 특히 확립되었다. 가장 간단한 생체 내 방법은 초파리 눈의 빛에 대한 상대적으로 큰 세포 외 기록 된 전압 반응을 이용합니다. 따라서, 광 자극은 척추동물 눈의 빛에 대한 ERG 반응보다 ∼3배 더 큰 세포외 전기망막(ERG) 기록을 사용하여 측정될 수 있는 전체 눈에서 전기 전압 반응을 불러일으킨다(8,9). 초파리 ERG 반응은 견고하고 쉽게 얻을 수 있으므로 돌연변이로 인한 광 반응의 이상을 확인하는 편리한 방법입니다. 빛에 대한 ERG 반응은 주로 광수용체, 색소 (glia) 세포 및 라미나의 이차 뉴런에서 발생합니다 (그림 1B 참조). ERG의 주요 구성 요소는 (i) 광수용체의 세포외 전압 반응, (ii) 라미나 뉴런으로부터 발생하는 광 자극의 시작과 끝에서의 “on” 및 “off” 과도 상태 (도 2A, inset, ON, OFF), (iii) 신경교세포의 느린 반응 (도 2A, inset, arrows), 및 (iv) 짧고 일시적인 반응이고, ON 과도 상태10보다 앞선 광안료 활성화 동안의 전하 변위로 인한 결과(도 2C[inset], D, E). 이 짧은 반응은 2 단계 (M1 및 M2, 그림 2C [inset])로 구성되며 수백만 개의 광안료 분자를 동시에 활성화시키는 매우 강한 광 자극에 의해서만 유도 될 수 있습니다. 청색 자극 (그림 2D, 청색 흔적) 또는 광색소 수준이 고도로 감소 된 돌연변이 (그림 2E, 적색 흔적)에서는 관찰되지 않지만 PLC 활성을 폐지하는 돌연변이에서 진폭이 약간 향상됩니다 (그림 2E, 주황색 흔적). M1 상은 광수용체에서 M의 활성화로부터 발생하는 파리의 전형적인 ERP이다. 긍정적 인 극성 (세포 내)을 갖는 M1 단계는 신호 반전 시냅스에서 정상적인 방식으로 신경 전달 물질을 방출하고 시냅스 적으로 증폭 된 M2 상을 생성하여 광수용체 탈분극에 반응하는 라미나 뉴런을 활성화시킵니다. 따라서, M1 및 M2 상 모두 M 활성화(10,11)를 반영한다.
광수용체의 탈분극은 각막 양성 “온” 과도기를 생성하며, 이는 라미나10,11의 광수용체 축색돌기와 단극성 뉴런 사이의 부호 반전 시냅스로부터 발생한다(도 1B). ERG의 느린 상승 및 붕괴는 주로 일시적인 수용체 전위 (TRP) 및 TRP 유사 (TRPL) 채널 13,14,15를 통한 광수용체 세포 (12)로부터의 K+ 유출로 인해 색소 세포의 탈분극 (도 2A, 인셋, 화살표)으로부터 발생한다. 이러한 느린 운동 성분은 광(9,10)에 대한 광수용체 반응의 세포내 또는 전체 세포 기록과 비교할 때 광수용체 반응의 파형을 크게 가릴 수 있고 왜곡시킨다. 또한, 매우 강한 조명에서, “온” 과도 상태와 선행하고 부분적으로 융합되는 추가적인 과도 응답이 관찰될 수 있다(그림 2C [inset],D,E). 이 신호는 광안료(10)의 거대한 활성화로부터 직접 기인한다.
중성 밀도 (ND) 및 컬러 필터뿐만 아니라 강력한 조명 플래시를 사용하는 여러 광 정권 프로토콜이 일반적으로 눈과 특히 광전달 캐스케이드를 조사하기 위해 개발되었습니다. 이들 프로토콜은 또한 광안료의 특성을 조사하기 위해 사용되었다.
강도-응답 프로토콜은 증가하는 광도에 대해 전체 눈의 ERG 전압 응답의 피크 진폭을 측정합니다(그림 2A,B). 이 프로토콜은 광수용체 9에대한 광수용체 세포의 민감도의 변화를 검출하는데 도움을 준다.
장기간의 탈분극 후전위(PDA) 프로토콜은 로돕신과 메타로돕신의 흡수 스펙트럼의 차이를 이용하여, 초파리에서 R의 광안료를 생리활성이고 암-안정한 중간체 M 상태2로 대량으로 전환시킬 수 있게 한다. ERG 전압 응답에서, 포화 광의 비교적 짧은 펄스가 주어지고, 그 결과 전압 응답이 기록된다. 이러한 조건 하에서, 천장(반전 전위)은 엄청난 양의 로돕신 분자(~1 x 10,8)의 퍼센트의 분율의 활성화가 천장에 도달하기에 충분하기 때문에 탈분극 신호에 의해 도달된다. 광전달 성분이 매우 풍부하게 존재하면 광전달 성분의 농도가 크게 감소하거나 미묘한 오작동이있는 돌연변이에서도 천장에 도달 할 수 있습니다. 이 상황은 이러한 돌연변이체의 분리를 배제한다. Pak et al.은 시각 돌연변이체를 분리하기 위한 신뢰성 있고 공개적인 시험을 추구하는 PDA 스크리닝7을 도입하였다. 초파리에서, PDA 반응은 광안료 전환을 허용하는 적색 스크리닝 안료를 유전적으로 제거하고, 로돕신에 의해 우선적으로 흡수되는 청색광의 적용에 의해 야기되고(도 3A), 따라서, R을 M 광안료 상태로 큰 순 전환을 초래한다. 광전달 종결은 R에서 M으로의 큰 순 변환에 의해 광안료의 수준에서 붕괴되고, 이는 차례로 광이 꺼진 후 오랫동안 지속적인 여기를 초래한다 (도 2C, 도 4A [상단]). PDA 기간 동안, 광수용체는 후속 테스트 라이트에 덜 민감하고 부분적으로 탈감작된다(불활성화). PDA는 로돕신 생물발생의 사소한 결함까지도 검출하고 장기간 흥분을 유지하기 위해 광수용체 세포의 최대 용량을 시험한다. 그것은 엄격하게 로돕신의 고농도의 존재에 의존하기 때문에, 그것은 쉽게 광전달 성분의 부족 보충에 대한 점수. 놀랍게도, PDA 스크린은 많은 새롭고 매우 중요한 시각적 돌연변이체를 산출하였다 (Pak et al.7에서 검토됨). 따라서, Pak et al.7에 의해 단리된 PDA 돌연변이체는 초파리 시각 시스템을 분석하는데 여전히 매우 유용하다.
PDA는 청색광을 포화시킴으로써 초파리에서 유도되어, 광 오프셋 후 오랫동안 지속적인 탈분극을 초래한다(그림 4A [상단]). PDA 유도 청색광을 포화시킨 후, 주변 광수용체(R1-6)는 최대 용량으로 어둠 속에서 지속적으로 활성 상태를 유지하여 포화에 도달한다. PDA 동안 추가적인 포화 청색광은 수초 동안 R1-6 세포에서 어떠한 추가적인 반응도 생성하지 않지만, PDA 상에 중첩되는 R7-8 세포에서 반응을 유도한다. 중첩된 반응은 이들 세포에서 발현된 광안료의 상이한 흡수 스펙트럼에 의해 설명된다(R7-8)16. PDA는 포화 오렌지 빛으로 M을 R로 다시 광변환함으로써 억제될 수 있다(그림 4A [상단]). 강렬한 백색광에 의해 달성 될 수없는 상황 인 광수용체 세포를 최대 활성 용량으로 가져 오는 PDA의 능력은 초파리의 시각적 돌연변이를 스크리닝하는 주요 도구 인 이유를 설명합니다. 이는 정상적인 광색소 수준17,18의 생물발생에 관여하는 단백질의 사소한 결함조차도 검출할 수 있기 때문이다. PDA 결함 돌연변이체의 두 그룹이 단리되었다: 불활성화 또는 사후전위(니나) 돌연변이체 및 불활성화는 아니지만 애프터포텐셜(ina) 돌연변이체는 아니다. 전자의 표현형은 광안료 수준의 큰 감소로부터 발생하는 PDA 및 연관된 불활성화의 결여이다(도 4A[중간]). 후자의 표현형은 정상적인 로돕신 수준을 가진 돌연변이체에서 아직 알려지지 않은 메커니즘으로 인해 불활성화를 나타내지 만 TRP 채널과 상호 작용하는 단백질이 부족하기 때문에 청색광 후 어두운 탈분극을 보이지 않습니다 (그림 4A [하단]).
PDA 는 M 활성19,20,21에 결합하고 종결시키는 레스틴(ARR2)에 비해 광안료의 양의 차이로부터 발생한다(도 1A). 초파리 광수용체에서, 광안료의 양은 ARR219의 양보다 약 5배 더 크다. 따라서, ARR2 수준은 R에서 M으로의 큰 순 광변환에 의해 생성된 모든 M 분자를 불활성화시키기에 불충분하고, 과량의 M이 어둠 속에서 지속적으로 활성화되도록 남겨둔다 17,19,20,22,23. 이 메카니즘은 돌연변이 또는 카로티노이드 박탈24,25에 의한 PDA 반응의 제거를 설명하고, 광안료 수준의 감소를 야기하지만, arrestin 수준에는 영향을 미치지 않는다. 더욱이, 이러한 설명은 또한 널 ARR2 (arr23) 돌연변이 대립유전자21의 표현형을 설명하는데, 여기서 PDA는 ~10배 조광기 청색 광 강도19,20,21에서 달성될 수 있었다(도 4B,C). PDA는 파리 광수용체의 독특한 특징이 아니며, R 상태와 다른 흡수 스펙트럼을 가진 어두운 안정한 M을 갖는 모든 테스트 된 종에서 나타나므로 R에서 M 상태로 광안료의 충분한 광변환이 가능합니다. PDA 현상학이 발견된 철저하게 조사된 종은 바나클(Balanus) 광수용체이며, 여기서 R 상태의 흡수 스펙트럼은 M 상태2보다 더 긴 파장에 있다(도 3B). 따라서, 파리의 상황과는 달리, 바나클에서는 주황색-적색광이 PDA를 유도하고, 청색광은PDA2를 억제한다.
초기 수용체 전위(ERP) 프로토콜은 R 또는 M 활성화 동안 발생하는 전하 변위를 이용한다. 시각 안료는 척추동물 및 무척추동물 막(3) 둘 다의 신호전달 구획의 표면막의 필수적인 부분이다. 따라서, 광안료 분자가 하나의 중간 상태에서 다음 상태로 변하는 활성화 과정은 전하 변위(4,26)를 수반한다. 광안료 분자가 막 커패시턴스(4)와 병렬로 전기적으로 정렬됨에 따라, 급격하게 동기화된 형태 변화는 표면 막의 빠른 분극 변화를 발생시키며, 파리에서는 횡문재라고 불리는 ~30,000-50,000 마이크로빌리의 스택으로 구성된 신호전달 구획에서 발생한다. 이 분극은 세포막이 똑같이 분극 될 때까지 세포체의 막 커패시턴스를 통해 수동적으로 방전됩니다. ERP는 전하 변위의 세포외 기록이다. 세포내 기록된 ERP는 세포막 4,27,28의 시간 상수에 의해 통합된 세포외 ERP를 나타낸다. 시각적 안료 전하 변위에 의해 활성화된 전류는 또한 전체 세포 전압 클램프 기록(29,30)(도 5A-D)에서 측정될 수 있었고, 신호의 동역학에 대한 막 커패시턴스의 영향을 최소화하는 주요 이점(초기 수용체 전류(ERC) 기록에서)을 갖는다.
프로토콜 섹션은 초파리 눈9에서 ERG 측정을 수행하는 방법 및 초파리 분리 옴마티디아31,32로부터의 전체 세포 기록에 의한 ERC 측정을 기술한다. 우리는 또한 일반적으로 광형질도입과 특히 광안료를 조사하는 데 사용되는 특정 프로토콜을 설명합니다.
Protocol
Representative Results
Discussion
초파리 광수용체 제제를 사용하는 가장 큰 장점은 접근성, 광 자극의 용이성 및 정확성, 그리고 가장 중요한 것은 분자 유전학의 힘을 적용 할 수있는 능력입니다 7. 광범위한 유전 연구는 초파리를 복잡한 생물학적 과정의 유전 적 해부를위한 매우 유용한 모델 시스템으로 확립했습니다7. 초파리 게놈의 비교적 간단한 구조 (X 및 Y 성 염색체, 2 개?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 연구는 이스라엘 과학 재단 (ISF)과 미국 – 이스라엘 이중 국가 과학 재단 (BSF)의 보조금으로 지원되었습니다. 왁스 필라멘트 히터 건설에 대해 Anatoly Shapochnikov 씨에게 감사드립니다.
Materials
| 1 mL syringe with elongated tip | Figure 6M | ||
| 1 rough tweezers | Dumont #5, Standard | 0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H) | |
| 2 condenser lenses | |||
| A/D converter | Molecular Device | Digidata 1200 | Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C |
| Amplifier | Almost perfect electronics | Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D | |
| Anti-vibration Table | Newport | VW-3036-OPT-01 | Figure 7H |
| Capillaries | Harvard Apparatus | Borosilicate glass capillaries | 1 mm x 0.58 mm (Figure 6O) |
| Clampex | Molecular Device | Software | |
| CO2 tank | |||
| Cold light source | Schott | KL1500 LCD | Figure 6C |
| Delicate wipers | Kimtech | Kimwipes (Figure 6K) | |
| Electrode holder | Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P) | ||
| Faraday cage | Home made | Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K) | |
| Filter (Color) | Schott | OG590, Edge filter | Figure 7S |
| Filter (Color) | Schott | BP450/40 nm | Figure 7S |
| Filter (Color) | Blazers | 550 nm | Figure 7S |
| Filter (Color) for cold light source | Schott | RG630 | Figure 6C |
| Filter (Heat) | Schott | KG3 | Figure 7S |
| Filters (Neutral density filter) | Chroma | 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 | Figure 7S |
| Flash Lamp system | Honeywell | Figure 7U | |
| Fly sleeper system with injector | Inject + matic | Figure 6A-B | |
| Lamp power supply | PTI | LPS-220 | Figure 7W |
| Light detector | Home made | Phototransistor (Figure 7O) | |
| Light guide | 3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M) | ||
| Light source | High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R) | ||
| Low temperature melting wax | Home made | Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J) | |
| Magnetic stand for flies | Home made | Figure 6I and Figure 7Q | |
| Microelectrode preamplifier system with head-stage | Almost perfect electronics | Impedance tester (Figure 7G) | |
| Micromanipulator (mechanical coarse) | Tritech Research, Narishige | M-2 | |
| Micromanipulator (mechanical fine) | Leitz Microsystems | Leitz Mechanical Micromanipulator | Figure 7F |
| pCLAMP | Molecular Device | Software | |
| Petri dish | 60 mm | ||
| Pulse generator | AMPI | Master 8 | Figure 7A |
| Redux cream for electrocardiography | Parker Laboratories | Redux Electrolyte Crème | |
| Shutter driver | Uniblitz, Vincent Associates | VCM-D1 Single Channel Uni-stable | Figure 7V |
| Shutter system | Uniblitz, Vincent Associates | LS2 2 mm Uni-stable Shutters | Figure 7V |
| Silver Wire | Warner Instruments | 0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized | |
| Soldering iron composed of a platinum-iridium filament | 0.25 mm diameter (Figure 6F) | ||
| Stereoscopic zoom Microscope | Nikon | SMZ-2B | Figure 6D |
| Stereoscopic zoom Microscope | Wild | Wild M5 | With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E) |
| Syringe filters | Millex | 22 µm PVDF filter | |
| Vertical pipette puller | Sutter/ Narishige | Model P-97/PP-830 | Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L) |
| Wax filament heater | Home made | See figure S1 (Figure 6E-G) | |
| Xenon Flash Lamp system | Dr. Rapp OptoElectronic | JML-C2 | Figure 7X |
References
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