Summary

Métodos Eletrofisiológicos para Medir Níveis de Fotopigment em Fotorreceptores de Drosophila

Published: June 02, 2022
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Summary

Apresentamos um protocolo para caracterizar eletrofisilogicamente fotopigmentações bie estáveis: (i) explorando os deslocamentos de carga dentro das moléculas de fotopigment após a absorção de fótons e sua enorme quantidade nos fotorreceptores, e (ii) explorando as diferenças de absorção-espectros dos estados de fotopigmento de rhodopsina e metarhodopsina. Esses protocolos são úteis para rastrear mutações que afetam sistemas de fotopigment biestabilidade.

Abstract

O drosophila G-protein-acoplado rhodopsin (R) é composto de uma proteína (opsina) e um cromoforeiro. O processo de ativação da rodopsina é iniciado pela isomerização indutora de absorção de fótons do cromoóforo, promovendo alterações conformais da opsina e resultando em um segundo estado de fotopigmento escuro-estável (metarhodopsina, M). A investigação deste fotopigment bi-estável usando mutagênese aleatória requer métodos simples e robustos para a triagem de moscas mutantes. Portanto, vários métodos para medir reduções nos níveis funcionais de fotopigment foram projetados. Um desses métodos explora os deslocamentos de carga dentro do fotopigment após a absorção de fótons e as enormes quantidades de moléculas de fotopigment expressas nos fotorreceptores. Este sinal elétrico, chamado de potencial receptor precoce (ou corrente de receptor precoce), é medido por uma variedade de métodos eletrofisiológicos (por exemplo, eletroretinograma e gravações de células inteiras) e é linearmente proporcional aos níveis de fotopigment funcional. As vantagens deste método são a alta relação sinal-ruído, a medição linear direta dos níveis de fotopigment e a independência dos mecanismos de fototransdução rio abaixo para a ativação de rodopsina ou metarhodopsina. Um método eletrofisiológico adicional chamado despolarização prolongada pós-potencial (PDA) explora a bi-estabilidade da fotopigment de Drosophila e as diferenças espectrais de absorção dos estados de pigmento R e M. O PDA é induzido por intensa luz azul, convertendo quantidades saturadas de rodopsina em metarhodopsina, resultando na falha da terminação de resposta à luz por um longo tempo na escuridão, mas pode ser terminada por metarhodopsina à conversão de rodopsina usando luz laranja intensa. Uma vez que o PDA é um sinal robusto que requer conversão maciça de fotopigment, mesmo pequenos defeitos na biogênese do fotopigamento levam a PDA anormal prontamente detectada. De fato, mutantes PDA defeituosos levaram à identificação de novas proteínas de sinalização importantes para a fototransdução.

Introduction

A rodopsina ativada pela luz (R), que é um receptor acoplado à proteína G (GPCR), é composta por uma proteína transmembrana 7 (opsina) e um cromoforo. Em Drosophila melanogaster (mosca-das-frutas), a absorção de fótons induz a isomerização do cromo de 11-cis-3-OH-retinal ao todo trans-3-OH-retinal 1, promovendo a mudança conformacional da rhodopsina para metarhodopsina (M, Figura 1A). Ao contrário da rodopsina vertebrado, a fração predominante do cromoforoto invertebrado não se dissocia da opsina, resultando no estado de pigmento fisiologicamente ativo e estável M. Por sua vez, a absorção adicional de fótons pelo cromoforo de retina totalmente trans-3-OH induz isomerização do cromoforo 2,3, gerando o estado de pigmento R com o cromotorgico 11-cis-3-OH-retinal. O estado R é um fotopigment escuro, estável e fisiologicamente não ativo. Além da rota de regeneração de fótons extremamente rápida do cromoforo4, assim como os fotopigmentos de vertebrados, existe uma rota lenta enzimática alternativa para a regeneração do cromóforo em invertebrados, em que alguns dos estágios são realizados em células da retina ao redor das células fotorreceptores 5,6.

A drosophila implica grandes vantagens como organismo modelo para estudar fotorreceptores invertebrados. Em particular, a acessibilidade da preparação e a capacidade de aplicar genética molecular tornaram o Drosophila um poderoso sistema modelo7. Assim, foram estabelecidos diversos métodos experimentais in vivo e ex vivo para o estudo da fototransdução em geral e em níveis de fotopigment, em particular. O método in vivo mais simples explora a resposta de tensão extracelularmente relativamente grande à luz do olho drosophila. Assim, a estimulação da luz evoca uma resposta de tensão elétrica em todo o olho que pode ser medida usando o registro de eletroretinograma extracelular (ERG), que é ~3 ordens de magnitude maior que a resposta ERG à luz dos olhos vertebrados 8,9. A resposta Drosophila ERG é robusta e facilmente obtida, o que o torna um método conveniente para identificar anormalidades na resposta à luz devido a mutações. A resposta do ERG à luz surge principalmente dos fotorreceptores, células pigmentantes (glia) e neurônios secundários da lâmina (ver Figura 1B). Os principais componentes do ERG são (i) a resposta de tensão extracelular dos fotoreceptores, (ii) os transitórios “on” e “off” no início e no fim do estímulo de luz que surgem dos neurônios lamina (Figura 2A, inset, ON, OFF), (iii) a resposta lenta das células glia (Figura 2A, inset, setas) e (iv) o breve e transitório, resposta resultante do deslocamento da carga durante a ativação do fotopigment que precede o ON transitório10 (Figura 2C [inset], D, E). Esta breve resposta é composta de duas fases (M1 e M2, Figura 2C [inset]) e só pode ser induzida por estimulação de luz extremamente forte, que ativa simultaneamente milhões de moléculas de fotopigment. Não é observada sob estimulação azul (Figura 2D, traço azul) nem em mutantes com níveis de fotopigment altamente reduzidos (Figura 2E, traço vermelho), mas sua amplitude é levemente aumentada em um mutante que abolia a atividade do PLC (Figura 2E, traço laranja). A fase M1 é um ERP típico da mosca decorrente da ativação de M nos fotorreceptores. A fase M1, que tem uma polaridade positiva (intracelularmente), libera um neurotransmissor da maneira normal em uma sinapse invertida de sinais e ativa os neurônios de lâmina, que respondem à despolarização do fotoreceptor gerando a fase M2 sintáticamente amplificada. Assim, ambas as fases M1 e M2 refletem a ativação M10,11.

A despolarização do fotoreceptor gera o transitório “on” córnea-positivo, decorrente da sinapse invertida entre o axônio fotorreceptor e os neurônios monopolares da lamina10,11 (Figura 1B). O lento aumento e decadência do ERG surge da despolarização das células pigmentadas (Figura 2A, inset, setas) principalmente devido ao Efflux K+ das células fotorreceptoras12 através dos canais receptores transitórios (TRP) e TRP-like (TRPL) 13,14,15. Esses componentes cinéticos lentos mascaram e distorcem em grande parte a forma de onda da resposta do fotorreceptor quando comparada às gravações intracelulares ou células inteiras da resposta do fotorreceptor à luz 9,10. Além disso, em iluminação muito forte, pode ser observada uma resposta transitória adicional, que precede e se funde parcialmente com o transitório “on”, (Figura 2C [inset],D,E). Este sinal se origina diretamente da ativação maciça do fotopigmento10.

Vários protocolos de regime de luz utilizando densidade neutra (ND) e filtros de cores, bem como fortes flashes iluminados, foram desenvolvidos para investigar o olho em geral e a cascata de fototransdução em particular. Esses protocolos também têm sido usados para investigar as propriedades do fotopigment.

O protocolo de intensidade-resposta mede o pico de amplitude da resposta de tensão ERG de todo o olho ao aumento das intensidades de luz (Figura 2A,B). Este protocolo auxilia na detecção de alterações na sensibilidade das células fotorreceptoras à luz9.

O protocolo de despolarização prolongada pós-potencial (PDA) explora as diferenças nos espectros de absorção de rhodopsin e metarhodopsina que permite, em Drosophila, uma conversão maciça de fotopigment de R para seu estado intermediário fisiologicamente ativo e estável escuroM 2. Na resposta de tensão ERG, é dado um pulso relativamente curto de luz saturada, e a resposta de tensão resultante é registrada. Sob essa condição, um teto (potencial de reversão) é atingido pelo sinal de despolarização porque a ativação de uma fração de por cento da enorme quantidade de moléculas de rodopsina (~1 x 108) é suficiente para atingir o teto. A presença dos componentes de fototransdução em grande abundância garante que este teto seja atingido mesmo em mutantes com uma redução significativa na concentração ou defeito sutil dos componentes de fototransdução. Esta situação impede o isolamento desses mutantes. Pak et al. introduziram a triagem PDA7 buscando um teste confiável e revelador para isolar mutantes visuais. Em Drosophila, a resposta do PDA é provocada pela remoção genética do pigmento de triagem vermelho, que permite a conversão de fotopigment, e a aplicação da luz azul, que é preferencialmente absorvida por rodopsina (Figura 3A) e, assim, resulta em uma grande conversão líquida do R para o estado de fotopigmentação M. A terminação de fototransdução é interrompida ao nível do fotopigment por uma grande conversão líquida de R para M, o que, por sua vez, resulta em excitação sustentada muito depois que a luz é desligada (Figura 2C, Figura 4A [topo]). Durante o período PDA, os fotorreceptores são menos sensíveis às luzes de teste subsequentes e são parcialmente dessensibilizados (inativados). O PDA detecta mesmo pequenos defeitos na biógnese de rodopsina e testa a capacidade máxima da célula fotorreceptora para manter a excitação por um longo período. Uma vez que depende estritamente da presença de altas concentrações de rodopsina, ele pontua facilmente para reposição deficiente dos componentes de fototransdução. Notavelmente, a tela do PDA rendeu muitos mutantes visuais novos e muito importantes (revisados em Pak et al.7). Assim, os mutantes do PDA isolados por Pak et al.7 ainda são extremamente úteis para analisar o sistema visual Drosophila .

O PDA é induzido em Drosophila pela saturação da luz azul, resultando em despolarização contínua muito tempo após o deslocamento da luz (Figura 4A [topo]). Após saturar a luz azul indutora de PDA, os fotorreceptores periféricos (R1-6) permanecem continuamente ativos no escuro em sua capacidade máxima, atingindo a saturação. Luzes azuis saturadas adicionais durante o PDA não produzem nenhuma resposta adicional em células R1-6 por muitos segundos, mas induzem uma resposta em células R7-8 que é sobreposta ao PDA. As respostas sobrepostas são explicadas pelos diferentes espectros de absorção dos fotopigmentamentos expressos nessas células (R7-8)16. O PDA pode ser suprimido pela fotoconversão de M de volta para R com luz laranja saturada (Figura 4A [topo]). A capacidade do PDA de trazer as células fotorreceptoras à sua capacidade ativa máxima, uma situação que não pode ser alcançada pela luz branca intensa, explica por que tem sido uma ferramenta importante para a triagem de mutantes visuais de Drosophila. Isso porque permite a detecção de pequenos defeitos em proteínas envolvidas na biogênese dos níveis normais de fotopigment17,18. Dois grupos de mutantes defeituosos do PDA foram isolados: nem inativação nem pós-potencial (nina) mutantes e inativação, mas não após mutantes (ina) ina. O fenótipo do primeiro é a falta de um PDA e a inativação associada decorrente de uma grande redução nos níveis de fotopigment (Figura 4A [meio]). O fenótipo deste último mostra inativação, mas sem despolarização escura após a luz azul devido a um mecanismo ainda desconhecido no mutante com níveis normais de rodopsina, mas sem proteínas interagindo com os canais TRP (Figura 4A [inferior]).

O PDA decorre da diferença na quantidade de fotopigment em relação à prisão (ARR2), que vincula e encerra a atividade M 19,20,21 (Figura 1A). Em fotorreceptores de Drosophila, a quantidade do fotopigment é cerca de cinco vezes maior que a quantidade de ARR219. Assim, os níveis de ARR2 são insuficientes para inativar todas as moléculas M geradas por uma grande fotoconversão líquida de R a M, deixando um excesso de M constantemente ativo no escuro 17,19,20,22,23. Este mecanismo explica a eliminação da resposta do PDA por mutações ou por privação decarotenoides 24,25, causando uma redução no nível de fotopigment, mas não afeta os níveis de detenção. Além disso, essa explicação também explica os fenótipos do alelo mutante ARR2 (arr23)21, no qual o PDA poderia ser alcançado em intensidades de luz azul 19,20,21 (Figura 4B,C). O PDA não é uma característica única de fotorreceptores de mosca, e aparece em todas as espécies testadas que tem M estável escuro com um espectro de absorção diferente do estado R, permitindo fotoconversão suficiente do fotopigment do R para o estado M. Uma espécie minuciosamente investigada em que a fenomenologia do PDA foi descoberta é o fotoreceptor de craca (Balanus), no qual o espectro de absorção do estado R está em um comprimento de onda mais longo do que o estado M2 (Figura 3B). Assim, ao contrário da situação na mosca, na craca, a luz laranja-vermelha induz um PDA, enquanto a luz azul suprime o PDA2.

O protocolo de potencial receptor (ERP) inicial explora o deslocamento de carga que ocorre durante a ativação de R ou M. O pigmento visual é parte integrante da membrana superficial do compartimento de sinalização das membranas vertebrados e invertebrados3. Assim, o processo de ativação em que as moléculas de fotopigmento mudam de um estado intermediário para o outro é acompanhado por um deslocamentode carga 4,26. Como as moléculas de fotopigmentão estão eletricamente alinhadas em paralelo com a capacitância da membrana4, uma rápida mudança conformacional sincronizada gera uma rápida mudança de polarização da membrana superficial, que, em moscas, ocorre no compartimento de sinalização composto por uma pilha de ~30.000-50.000 microvilli chamado rabdomi. Essa polarização então descarrega passivamente através da capacitância da membrana do corpo celular até que a membrana celular esteja igualmente polarizada. O ERP é a gravação extracelular do deslocamento da carga. O ERP registrado intracelularmente manifesta o ERP extracelular integrado pela constante de tempo da membranacelular 4,27,28. A corrente ativada pelo deslocamento da carga de pigmento visual também poderia ser medida em gravações de tensão-grampo de tensão de células inteiras29,30 (Figura 5A-D), com a maior vantagem (nas gravações de corrente receptora precoce (ERC) de minimizar o efeito da capacitância da membrana na cinética do sinal.

A seção de protocolo descreve como realizar medições de ERG a partir de medições de olho Drosophila 9 e ERC por gravações de células inteiras de Drosophila isolada ommatidia31,32. Também descrevemos protocolos específicos que são usados para investigar a fototransdução em geral e fotopigments em particular.

Protocol

1. Medindo a relação de resposta à intensidade, despolarização prolongada após o potencial (PDA) e o potencial do receptor precoce (ERP) usando o eletroretinograma Condições adequadas de criação para a preparação de D. melanogaster Raise D. melanogaster voa em garrafas contendo milho amarelo padrão contendo alimentos em uma incubadora mantida a uma temperatura de 24 °C e em um ciclo escuro/claro de 12 horas Mantenha as garrafas de mosca no escu…

Representative Results

A Figura 2 exemplifica a robustez e a facilidade de utilização da técnica ERG. É robusto porque é gravado na mosca praticamente intacta por uma técnica simples de gravações de tensão extracelular que requerem uma simples configuração eletrofisiológica. A robustez se manifesta pela obtenção de gravações de respostas de luz com amplitudes relativamente grandes (na faixa de milívolos) mesmo quando mutações reduzem fortemente ou distorcem a resposta à luz. Portanto, mesmo um …

Discussion

A maior vantagem do uso da preparação do fotorreceptor Drosophila é sua acessibilidade, a facilidade e precisão da estimulação da luz e, o mais importante, a capacidade de aplicar o poder da genética molecular7. Estudos genéticos extensivos estabeleceram o Drosophila como um sistema modelo extremamente útil para a dissecção genética de processos biológicos complexos7. A estrutura relativamente simples do genoma de Drosophila (composto…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Esta pesquisa foi apoiada por subsídios da Israel Science Foundation (ISF) e da United States-Israel Binational Science Foundation (BSF). Agradecemos ao Sr. Anatoly Shapochnikov pela construção do aquecedor de filamento de cera.

Materials

1 mL syringe with elongated tip Figure 6M
1 rough tweezers Dumont #5, Standard 0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 condenser lenses
A/D converter Molecular Device Digidata 1200 Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C
Amplifier Almost perfect electronics Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D
Anti-vibration Table Newport VW-3036-OPT-01 Figure 7H
Capillaries Harvard Apparatus Borosilicate glass capillaries 1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)
Clampex Molecular Device Software
CO2 tank
Cold light source Schott KL1500 LCD Figure 6C
Delicate wipers Kimtech Kimwipes (Figure 6K)
Electrode holder Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)
Faraday cage Home made Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)
Filter (Color) Schott OG590, Edge filter Figure 7S
Filter (Color) Schott BP450/40 nm Figure 7S
Filter (Color) Blazers 550 nm Figure 7S
Filter (Color) for cold light source Schott RG630 Figure 6C
Filter (Heat) Schott KG3 Figure 7S
Filters (Neutral density filter) Chroma 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 Figure 7S
Flash Lamp system Honeywell Figure 7U
Fly sleeper system with injector Inject + matic Figure 6A-B
Lamp power supply PTI LPS-220 Figure 7W
Light detector Home made Phototransistor (Figure 7O)
Light guide 3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)
Light source High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)
Low temperature melting wax Home made Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J)
Magnetic stand for flies Home made Figure 6I and Figure 7Q
Microelectrode preamplifier system with head-stage Almost perfect electronics Impedance tester (Figure 7G)
Micromanipulator (mechanical coarse) Tritech Research, Narishige M-2
Micromanipulator (mechanical fine) Leitz Microsystems Leitz Mechanical Micromanipulator Figure 7F
pCLAMP Molecular Device Software
Petri dish 60 mm
Pulse generator AMPI Master 8 Figure 7A
Redux cream for electrocardiography Parker Laboratories Redux Electrolyte Crème
Shutter driver Uniblitz, Vincent Associates VCM-D1 Single Channel Uni-stable Figure 7V
Shutter system Uniblitz, Vincent Associates LS2 2 mm Uni-stable Shutters Figure 7V
Silver Wire Warner Instruments 0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament 0.25 mm diameter (Figure 6F)
Stereoscopic zoom Microscope Nikon SMZ-2B Figure 6D
Stereoscopic zoom Microscope Wild Wild M5 With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)
Syringe filters Millex 22 µm PVDF filter
Vertical pipette puller Sutter/ Narishige Model P-97/PP-830 Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)
Wax filament heater Home made See figure S1 (Figure 6E-G)
Xenon Flash Lamp system Dr. Rapp OptoElectronic JML-C2 Figure 7X

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Cite This Article
Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors. J. Vis. Exp. (184), e63514, doi:10.3791/63514 (2022).

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