Summary

Drosophila Fotoreseptörlerinde Fotopigment Düzeylerini Ölçmek için Elektrofizyolojik Yöntemler

Published: June 02, 2022
doi:

Summary

Bi-stabil fotopigmentleri elektrofizyolojik olarak karakterize etmek için bir protokol sunuyoruz: (i) foton absorpsiyonunu takiben fotopigment molekülleri içindeki yük yer değiştirmelerini ve fotoreseptörlerdeki büyük miktarlarını kullanmak ve (ii) rodopsin ve metarodopsin fotopigment durumlarının emilim-spektrum farklılıklarından yararlanmak. Bu protokoller, bi-stabil fotopigment sistemlerini etkileyen mutasyonları taramak için yararlıdır.

Abstract

Drosophila G-proteinine bağlı fotopigment rodopsin ( R ) bir protein (opsin) ve bir kromofordan oluşur . Rodopsinin aktivasyon süreci, kromoforun foton emilimine neden olan izomerizasyonu ile başlatılır, opsinin konformasyonel değişikliklerini teşvik eder ve ikinci bir koyu kararlı fotopigment durumu (metarhodopsin, M) ile sonuçlanır. Bu iki kararlı fotopigmentin rastgele mutajenez kullanılarak araştırılması, mutant sineklerin taranması için basit ve sağlam yöntemler gerektirir. Bu nedenle, fonksiyonel fotopigment seviyelerindeki azalmaları ölçmek için çeşitli yöntemler tasarlanmıştır. Böyle bir yöntem, foton emilimini takiben fotopigment içindeki yük yer değiştirmelerini ve fotoreseptörlerde eksprese edilen büyük miktarda fotopigment molekülünü kullanır. Erken reseptör potansiyeli (veya erken reseptör akımı) olarak adlandırılan bu elektrik sinyali, çeşitli elektrofizyolojik yöntemlerle (örneğin, elektroretinogram ve tüm hücre kayıtları) ölçülür ve fonksiyonel fotopigment seviyeleri ile doğrusal olarak orantılıdır. Bu yöntemin avantajları, yüksek sinyal-gürültü oranı, fotopigment seviyelerinin doğrudan doğrusal ölçümü ve rodopsin veya metarodopsin aktivasyonuna kadar aşağı akış fototransdüksiyon mekanizmalarının bağımsızlığıdır. Uzun süreli depolarize edici artçı potansiyel (PDA) adı verilen ek bir elektrofizyolojik yöntem, Drosophila fotopigmentinin bi-stabilitesini ve sinek R ve M pigment durumlarının emilim-spektral farklılıklarını kullanır. PDA, yoğun mavi ışık tarafından indüklenir, doygun miktarda rodopsinin metarodopsine dönüştürülmesi, karanlıkta uzun bir süre boyunca ışık tepkisi sonlandırmasının başarısız olmasına neden olur, ancak yoğun turuncu ışık kullanılarak metarodopsin’den rodopsine dönüşüm ile sonlandırılabilir. PDA, büyük fotopigment dönüşümü gerektiren sağlam bir sinyal olduğundan, fotopigmentin biyogenezindeki küçük kusurlar bile kolayca tespit edilen anormal PDA’ya yol açar. Gerçekten de, kusurlu PDA mutantları, fototransdüksiyon için önemli olan yeni sinyal proteinlerinin tanımlanmasına yol açmıştır.

Introduction

Bir G-proteinine bağlı reseptör (GPCR) olan ışıkla aktive olmuş rodopsin ( R ), bir 7 transmembran proteini (opsin) ve bir kromofordan oluşur . Drosophila melanogaster’de (meyve sineği), foton absorpsiyonu, 11-cis-3-OH-retinal kromoforun all-trans-3-OH-retinal1’e izomerizasyonunu indükleyerek rodopsinin metarodopsine konformasyonel değişimini teşvik eder (M, Şekil 1A). Omurgalı rodopsinin aksine, omurgasız kromoforun baskın fraksiyonu opsin’den ayrışmaz, bu da fizyolojik olarak aktif koyu kararlı pigment durumu M ile sonuçlanır. Buna karşılık, all-trans-3-OH-retinal kromofor tarafından ilave foton emilimi, kromofor 2,3’ün izomerizasyonunu indükleyerek 11-cis-3-OH-retinal kromofor ile R pigment durumunu oluşturur. R durumu karanlık, stabil ve fizyolojik olarak aktif olmayan bir fotopigmenttir. Kromozom4’ün son derece hızlı foton rejenerasyon yoluna ek olarak, omurgalı fotopigmentleri gibi, omurgasızlarda kromofor rejenerasyonu için alternatif bir enzimatik yavaş yol vardır, burada bazı aşamalar fotoreseptör hücrelerini çevreleyen retinal hücrelerde gerçekleştirilir 5,6.

Drosophila, omurgasız fotoreseptörleri incelemek için model bir organizma olarak büyük avantajlar sağlar. Özellikle, preparatın erişilebilirliği ve moleküler genetiği uygulama yeteneği, Drosophila’yı güçlü bir model sistem haline getirmiştir7. Bu nedenle, genel olarak fototransdüksiyonu ve özellikle fotopigment seviyelerini incelemek için çeşitli in vivo ve ex vivo deneysel yöntemler oluşturulmuştur. En basit in-vivo yöntem, Drosophila gözünün ışığına nispeten büyük hücre dışı olarak kaydedilen voltaj tepkisinden yararlanır. Buna göre, ışık stimülasyonu, tüm gözde, omurgalı gözlerinin ışığına verilen ERG tepkisinden ~ 3 kat daha büyük olan hücre dışı elektroretinogram (ERG) kaydı kullanılarak ölçülebilen bir elektriksel voltaj tepkisi uyandırır 8,9. Drosophila ERG yanıtı sağlamdır ve kolayca elde edilir, bu da mutasyonlara bağlı ışık tepkisindeki anormallikleri tanımlamak için uygun bir yöntemdir. Işığa karşı ERG yanıtı esas olarak fotoreseptörlerden, pigment (glia) hücrelerinden ve laminanın ikincil nöronlarından kaynaklanır (bkz. Şekil 1B). ERG’nin ana bileşenleri (i) fotoreseptörlerin hücre dışı voltaj tepkisi, (ii) lamina nöronlarından kaynaklanan ışık uyaranının başlangıcındaki ve sonundaki “açık” ve “kapalı” geçicilerdir (Şekil 2A, giriş, AÇIK, KAPALI), (iii) glia hücrelerinin yavaş tepkisi (Şekil 2A, giriş, oklar) ve (iv) kısa ve geçici yanıt, fotopigment aktivasyonu sırasında ON geçici10’dan önce gelen yük yer değiştirmesinden kaynaklanır (Şekil 2C [giriş], D, E). Bu kısa yanıt iki fazdan oluşur (M1 ve M2, Şekil 2C [giriş]) ve sadece milyonlarca fotopigment molekülünü aynı anda aktive eden son derece güçlü ışık stimülasyonu ile indüklenebilir. Ne mavi stimülasyon altında (Şekil 2D, mavi iz) ne de fotopigment seviyeleri oldukça azalmış mutantlarda (Şekil 2E, kırmızı iz) gözlenmez, ancak PLC aktivitesini ortadan kaldıran bir mutantta genliği hafifçe artar (Şekil 2E, turuncu iz). M1 fazı, fotoreseptörlerde M’nin aktivasyonundan kaynaklanan sineğin tipik bir ERP’sidir. Pozitif bir polariteye sahip olan M1 fazı (hücre içi), işaret ters çeviren bir sinapsta normal şekilde bir nörotransmitter salgılar ve sinaptik olarak güçlendirilmiş M2 fazını üreterek fotoreseptör depolarizasyonuna yanıt veren lamina nöronlarını aktive eder. Böylece, hem M1 hem de M2 fazları M aktivasyonu10,11’i yansıtır.

Fotoreseptörün depolarizasyonu, fotoreseptör akson ile lamina10,11’in monopolar nöronları arasındaki işaret ters çeviren sinapstan kaynaklanan kornea pozitif “on” geçicisini üretir (Şekil 1B). ERG’nin yavaş yükselmesi ve çürümesi, esas olarak geçici reseptör potansiyeli (TRP) ve TRP benzeri (TRPL) kanallar 13,14,15 aracılığıyla fotoreseptör hücrelerinden 12 K+ efflux nedeniyle pigment hücrelerinin depolarizasyonundan kaynaklanır (Şekil 2A, iç kısım, oklar). Bu yavaş kinetik bileşenler, fotoreseptör yanıtınınışık 9,10’a verdiği yanıtın hücre içi veya tüm hücre kayıtlarıyla karşılaştırıldığında, fotoreseptör yanıtının dalga formunu büyük ölçüde maskeler ve bozar. Ek olarak, çok güçlü aydınlatmalarda, “açık” geçiciden önce gelen ve kısmen kaynaşan ek bir geçici tepki gözlenebilir (Şekil 2C [giriş], D, E). Bu sinyal doğrudan fotopigment10’un masif aktivasyonundan kaynaklanır.

Genel olarak gözü ve özellikle fototransdüksiyon kaskadını araştırmak için nötr yoğunluk (ND) ve renk filtrelerinin yanı sıra güçlü aydınlatıcı flaşlar kullanan çeşitli ışık rejimi protokolleri geliştirilmiştir. Bu protokoller fotopigmentin özelliklerini araştırmak için de kullanılmıştır.

Yoğunluk-yanıt protokolü, tüm gözün artan ışık yoğunluklarına karşı ERG voltaj tepkisinin tepe genliğini ölçer (Şekil 2A, B). Bu protokol, fotoreseptör hücrelerin ışığa duyarlılığındaki değişiklikleri tespit etmeye yardımcıolur 9.

Uzun süreli depolarize edici artçı potansiyel (PDA) protokolü, rodopsin ve metarodopsinin absorpsiyon spektrumlarındaki farklılıklardan yararlanır ve bu da Drosophila’da, R’nin fizyolojik olarak aktif ve koyu kararlı ara M durumu2’ye büyük bir fotopigment dönüşümüne izin verir. ERG voltaj tepkisinde, nispeten kısa bir doygunluk ışığı darbesi verilir ve ortaya çıkan voltaj tepkisi kaydedilir. Bu durumda, depolarizasyon sinyali ile bir tavana (tersine çevirme potansiyeli) ulaşılır, çünkü büyük miktarda rodopsin molekülünün (~ 1 x 108) yüzde birinin aktivasyonu tavana ulaşmak için yeterlidir. Fototransdüksiyon bileşenlerinin bolca bulunması, bu tavana, konsantrasyonda önemli bir azalma veya fototransdüksiyon bileşenlerinin ince bir arızası ile mutantlarda bile ulaşılmasını sağlar. Bu durum bu mutantların izolasyonunu engellemektedir. Pak ve ark., görsel mutantları izole etmek için güvenilir ve açıklayıcı bir test arayan PDA tarama7’yi tanıttı. Drosophila’da , PDA yanıtı, fotopigment dönüşümüne izin veren kırmızı tarama pigmentinin genetik olarak çıkarılması ve tercihen rodopsin tarafından emilen mavi ışığın uygulanması (Şekil 3A) ile ortaya çıkar ve böylece R’nin M fotopigment durumuna büyük bir net dönüşümü ile sonuçlanır. Fototransdüksiyon sonlandırması, fotopigment seviyesinde, R’nin M’ye büyük bir net dönüşümü ile bozulur ve bu da ışık kapatıldıktan çok sonra sürekli uyarılma ile sonuçlanır (Şekil 2C, Şekil 4A [üst]). PDA döneminde, fotoreseptörler sonraki test ışıklarına karşı daha az hassastır ve kısmen duyarsızlaştırılır (inaktive edilir). PDA, rodopsin biyogenezindeki küçük kusurları bile tespit eder ve uzun süre uyarılmayı sürdürmek için fotoreseptör hücrenin maksimum kapasitesini test eder. Kesinlikle yüksek konsantrasyonlarda rodopsin varlığına bağlı olduğundan, fototransdüksiyon bileşenlerinin eksik yenilenmesi için kolayca puan alır. Dikkat çekici bir şekilde, PDA ekranı birçok yeni ve çok önemli görsel mutant vermiştir (Pak ve ark.7’de gözden geçirilmiştir). Bu nedenle, Pak ve ark.7 tarafından izole edilen PDA mutantları, Drosophila görsel sistemini analiz etmek için hala son derece yararlıdır.

PDA, Drosophila’da mavi ışığı doyurarak indüklenir ve ışık ofsetinden çok sonra sürekli depolarizasyona neden olur (Şekil 4A [üst]). PDA ile indükleyen mavi ışığı doyurduktan sonra, periferik fotoreseptörler (R1-6) karanlıkta maksimum kapasitelerinde sürekli aktif kalır ve doygunluğa ulaşır. PDA sırasında ilave doygun mavi ışıklar, R1-6 hücrelerinde saniyeler boyunca herhangi bir ek yanıt üretmez, ancak PDA üzerine bindirilmiş R7-8 hücrelerinde bir yanıt indükler. Üst üste binen tepkiler, bu hücrelerde eksprese edilen fotopigmentlerin farklı absorpsiyon spektrumları ile açıklanmaktadır (R7-8)16. PDA, M’nin doygun turuncu ışıkla R’ye geri fotodönüşümü ile bastırılabilir (Şekil 4A [üst]). PDA’nın fotoreseptör hücrelerini maksimum aktif kapasitelerine getirme yeteneği, yoğun beyaz ışıkla elde edilemeyen bir durum, Drosophila’nın görsel mutantlarını taramak için neden önemli bir araç olduğunu açıklıyor. Bunun nedeni, normal fotopigment seviyelerinin biyogenezinde rol oynayan proteinlerdeki küçük kusurların bile tespit edilmesine izin vermesidir17,18. İki grup PDA kusurlu mutantı izole edilmiştir: ne inaktivasyon ne de postpotansiyel (nina) mutantlar ve inaktivasyon, ancak postpotansiyel (ina) mutantlar değil. İlkinin fenotipi, bir PDA eksikliği ve fotopigment seviyelerindeki büyük bir azalmadan kaynaklanan ilişkili inaktivasyondur (Şekil 4A [orta]). İkincisinin fenotipi, mutantta normal rodopsin seviyelerine sahip, ancak TRP kanallarıyla etkileşime giren proteinlerden yoksun olan hala bilinmeyen bir mekanizma nedeniyle mavi ışıktan sonra inaktivasyon gösterir, ancak karanlık depolarizasyon yoktur (Şekil 4A [alt]).

PDA, M aktivitesi 19,20,21’i bağlayan ve sonlandıran arrestine (ARR2) göre fotopigment miktarındaki farktan kaynaklanır (Şekil 1A). Drosophila fotoreseptörlerinde, fotopigment miktarı ARR219 miktarından yaklaşık beş kat daha büyüktür. Bu nedenle, ARR2 seviyeleri, R’den M’ye büyük bir net fotodönüşümü ile üretilen tüm M moleküllerini etkisiz hale getirmek için yetersizdir ve karanlıkta 17,19,20,22,23 sürekli aktif olan M fazlalığını bırakır. Bu mekanizma, PDA yanıtının mutasyonlarla veya karotenoid yoksunluğu24,25 ile ortadan kaldırılmasını açıklar, fotopigment seviyesinde bir azalmaya neden olur, ancak arrestin seviyelerini etkilemez. Dahası, bu açıklama aynı zamanda null ARR2 (arr23) mutant alel21’in fenotiplerini de açıklamaktadır, burada PDA, ~ 10 kat daha kısık mavi ışık yoğunluklarında19,20,21’de elde edilebilir (Şekil 4B, C). PDA, sinek fotoreseptörlerinin benzersiz bir özelliği değildir ve R durumundan farklı bir absorpsiyon spektrumuna sahip karanlık kararlı M’ye sahip test edilen her türde ortaya çıkar ve fotopigmentin R’den M durumuna yeterli fotodönüşümüne izin verir. PDA fenomenolojisinin keşfedildiği iyice araştırılmış bir tür, R durumunun absorpsiyon spektrumunun M durumu2’den daha uzun bir dalga boyunda olduğu barnacle (Balanus) fotoreseptörüdür (Şekil 3B). Buna göre, sinekteki durumun aksine, ahırda, turuncu-kırmızı ışık bir PDA’yı indüklerken, mavi ışık PDA2’yi bastırır.

Erken reseptör potansiyeli (ERP) protokolü, R veya M aktivasyonu sırasında meydana gelen yük yer değiştirmesinden yararlanır. Görsel pigment, hem omurgalı hem de omurgasız membranların sinyal bölmesinin yüzey zarının ayrılmaz bir parçasıdır3. Buna göre, fotopigment moleküllerinin bir ara durumdan diğerine değiştiği aktivasyon sürecine, 4,26’lık bir yük yer değiştirmesi eşlik eder. Fotopigment molekülleri, membran kapasitansı4’e paralel olarak elektriksel olarak hizalandığından, hızlı bir senkronize konformasyonel değişim, yüzey zarının hızlı bir polarizasyon değişimini üretir; bu, sineklerde, rabdomere adı verilen ~ 30.000-50.000 mikrovillusluk bir yığından oluşan sinyal bölmesinde meydana gelir. Bu polarizasyon daha sonra hücre zarı eşit derecede polarize olana kadar hücre gövdesinin membran kapasitansından pasif olarak boşalır. ERP, yük yer değiştirmesinin hücre dışı kaydıdır. Hücre içi olarak kaydedilen ERP,hücre zarının zaman sabiti 4,27,28 ile entegre edilmiş hücre dışı ERP’yi gösterir. Görsel pigment yükü deplasmanı tarafından aktive edilen akım, membran kapasitansının sinyalin kinetik üzerindeki etkisini en aza indirmenin en büyük avantajı (erken reseptör akımı (ERC) kayıtları) ile tüm hücre voltaj kelepçesi kayıtlarında29,30 (Şekil 5A-D) olarak da ölçülebilir.

Protokol bölümü, Drosophila göz9’dan ERG ölçümlerinin ve Drosophila izole ommatidia 31,32’den tüm hücre kayıtlarıyla ERC ölçümlerinin nasıl yapılacağını açıklamaktadır. Ayrıca, genel olarak fototransdüksiyonu ve özellikle fotopigmentleri araştırmak için kullanılan spesifik protokolleri de açıklıyoruz.

Protocol

1. Elektroretinogram kullanılarak yoğunluk yanıtı ilişkisinin, uzamış depolarizan artçı potansiyelin (PDA) ve erken reseptör potansiyelinin (ERP) ölçülmesi D. melanogaster hazırlığı için uygun yetiştirme koşulları D. melanogaster sineklerini, 24 ° C sıcaklıkta ve 12 saatlik karanlık / ışık döngüsünde tutulan bir inkübatörde yiyecek içeren standart sarı mısır içeren şişelerde yükseltin Sinek şişelerini deneyden en az…

Representative Results

Şekil 2, ERG tekniğinin sağlamlığını ve kullanım kolaylığını örneklemektedir. Sağlamdır, çünkü basit bir elektrofizyolojik kurulum gerektiren basit bir hücre dışı voltaj kayıtları tekniği ile neredeyse bozulmamış sinekte kaydedilir. Sağlamlık, mutasyonlar ışık tepkisini güçlü bir şekilde azalttığında veya bozduğunda bile, nispeten büyük genliklere sahip (milivolt aralığında) ışık tepkilerinin kayıtlarının elde edilmesiyle kendini gösterir. …

Discussion

Drosophila fotoreseptör preparatını kullanmanın en büyük avantajı, erişilebilirliği, ışık stimülasyonunun kolaylığı ve doğruluğu ve en önemlisi, moleküler genetiğin gücünü uygulama yeteneğidir7. Kapsamlı genetik çalışmalar, Drosophila’yı karmaşık biyolojik süreçlerin genetik diseksiyonu için son derece yararlı bir model sistem olarak kurmuştur7. Drosophila genomunun nispeten basit yapısı (X ve Y cinsiyet kro…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Bu araştırma, İsrail Bilim Vakfı (ISF) ve Amerika Birleşik Devletleri-İsrail İki Uluslu Bilim Vakfı (BSF) tarafından desteklenmiştir. Balmumu filament ısıtıcısının yapımı için Bay Anatoly Shapochnikov’a teşekkür ederiz.

Materials

1 mL syringe with elongated tip Figure 6M
1 rough tweezers Dumont #5, Standard 0.1 mm x 0.06 mm, length 110 mm, Inox (Figure 6H)
2 condenser lenses
A/D converter Molecular Device Digidata 1200 Possible replacement: any digidata from molecular devices (e.g 1440A) -Figure 7C
Amplifier Almost perfect electronics Possible replacement: Warner instruments- IE251A or IE-210 (comes with headstage)- Figure 7D
Anti-vibration Table Newport VW-3036-OPT-01 Figure 7H
Capillaries Harvard Apparatus Borosilicate glass capillaries 1 mm x 0.58 mm (Figure 6O)
Clampex Molecular Device Software
CO2 tank
Cold light source Schott KL1500 LCD Figure 6C
Delicate wipers Kimtech Kimwipes (Figure 6K)
Electrode holder Suitable for capillary O.D. 1 mm (Figure 6N, Figure 7N, and Figure 7P)
Faraday cage Home made Electromagnetic noise shielding and black front curtain (Figure 7K)
Filter (Color) Schott OG590, Edge filter Figure 7S
Filter (Color) Schott BP450/40 nm Figure 7S
Filter (Color) Blazers 550 nm Figure 7S
Filter (Color) for cold light source Schott RG630 Figure 6C
Filter (Heat) Schott KG3 Figure 7S
Filters (Neutral density filter) Chroma 6,5,4,3,2,1,0.5,0.3 Figure 7S
Flash Lamp system Honeywell Figure 7U
Fly sleeper system with injector Inject + matic Figure 6A-B
Lamp power supply PTI LPS-220 Figure 7W
Light detector Home made Phototransistor (Figure 7O)
Light guide 3 mm diameter, 1.3 m long (Figure 7L,M)
Light source High-pressure ozone-free 75 W Xenon lamp (operating on 50 W), possible replacement: Cairn research- OptoLED (Figure 7R)
Low temperature melting wax Home made Composed of mixture of beeswax (Tm≈62 °C) and paraffin at ~3:1 to reach a melting temperature of ~55–56 °C (Figure 6J)
Magnetic stand for flies Home made Figure 6I and Figure 7Q
Microelectrode preamplifier system with head-stage Almost perfect electronics Impedance tester (Figure 7G)
Micromanipulator (mechanical coarse) Tritech Research, Narishige M-2
Micromanipulator (mechanical fine) Leitz Microsystems Leitz Mechanical Micromanipulator Figure 7F
pCLAMP Molecular Device Software
Petri dish 60 mm
Pulse generator AMPI Master 8 Figure 7A
Redux cream for electrocardiography Parker Laboratories Redux Electrolyte Crème
Shutter driver Uniblitz, Vincent Associates VCM-D1 Single Channel Uni-stable Figure 7V
Shutter system Uniblitz, Vincent Associates LS2 2 mm Uni-stable Shutters Figure 7V
Silver Wire Warner Instruments 0.25–1 mm diameter, needs to be chloridized
Soldering iron composed of a platinum-iridium filament 0.25 mm diameter (Figure 6F)
Stereoscopic zoom Microscope Nikon SMZ-2B Figure 6D
Stereoscopic zoom Microscope Wild Wild M5 With 6, 12, 25 and 50 magnification settings (Figure 7E)
Syringe filters Millex 22 µm PVDF filter
Vertical pipette puller Sutter/ Narishige Model P-97/PP-830 Use either vertical or horizontal puller, as preferred (Figure 6L)
Wax filament heater Home made See figure S1 (Figure 6E-G)
Xenon Flash Lamp system Dr. Rapp OptoElectronic JML-C2 Figure 7X

References

  1. Vogt, K., Kirschfeld, K. Chemical identity of the chromophores of fly visual pigment. Naturwissenschaften. 77, 211-213 (1984).
  2. Hillman, P., Hochstein, S., Minke, B. Transduction in invertebrate photoreceptors: role of pigment bistability. Physiological Reviews. 63 (2), 668 (1983).
  3. Hamdorf, K., Autrum, H. . Handbook of Sensory Physiology. Comparative Physiology and Evolution of Vision in Invertebrates. 7, 145-224 (1979).
  4. Gagné, S., Roebroek, J. G., Stavenga, D. G. Enigma of early receptor potential in fly eyes. Vision Research. 29 (12), 1663-1670 (1989).
  5. Pak, W. L., Shino, S., Leung, H. T. PDA (prolonged depolarizing afterpotential)-defective mutants: the story of nina’s and ina’s–pinta and santa maria, too. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 216-237 (2012).
  6. Wang, X., Wang, T., Jiao, Y., von, L. J., Montell, C. Requirement for an enzymatic visual cycle in Drosophila. Current Biology. 20 (2), 93-102 (2010).
  7. Pak, W. L. Drosophila in vision research. The Friedenwald lecture. Investigative Ophthalmology & Visual Science. 36 (12), 2340-2357 (1995).
  8. Pak, W. L., Breakfield, X. . Neurogenetics, Genetic Approaches to the Nervous System. , 67-99 (1979).
  9. Minke, B. Light-induced reduction in excitation efficiency in the trp mutant of Drosophila. The Journal of General Physiology. 79, 361-385 (1982).
  10. Minke, B., Kirschfeld, K. Fast electrical potentials arising from activation of metarhodopsin in the fly. The Journal of General Physiology. 75 (4), 381-402 (1980).
  11. Stephenson, R. S., Pak, W. L. Heterogenic components of a fast electrical potential in Drosophila compound eye and their relation to visual pigment photoconversion. The Journal of General Physiology. 75 (4), 353-379 (1980).
  12. Agam, K., et al. Metabolic stress reversibly activates the Drosophila light-sensitive channels TRP and TRPL in vivo. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 20 (15), 5748-5755 (2000).
  13. Hardie, R. C., Minke, B. The trp gene is essential for a light-activated Ca2+ channel in Drosophila photoreceptors. Neuron. 8, 643-651 (1992).
  14. Niemeyer, B. A., Suzuki, E., Scott, K., Jalink, K., Zuker, C. S. The Drosophila light-activated conductance is composed of the two channels TRP and TRPL. Cell. 85 (5), 651-659 (1996).
  15. Phillips, A. M., Bull, A., Kelly, L. E. Identification of a Drosophila gene encoding a calmodulin-binding protein with homology to the trp phototransduction gene. Neuron. 8, 631-642 (1992).
  16. Minke, B., Wu, C. F., Pak, W. L. Isolation of light-induced response of the central retinular cells from the electroretinogram of Drosophila. Journal of Comparative Physiology. 98, 345-355 (1975).
  17. Selinger, Z., Doza, Y. N., Minke, B. Mechanisms and genetics of photoreceptors desensitization in Drosophila flies. Biochimica et Biophysica Acta. 1179, 283-299 (1993).
  18. Minke, B. The history of the prolonged depolarizing afterpotential (PDA) and its role in genetic dissection of Drosophila phototransduction. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 106-117 (2012).
  19. Satoh, A. K., et al. Arrestin translocation is stoichiometric to rhodopsin isomerization and accelerated by phototransduction in Drosophila photoreceptors. Neuron. 67 (6), 997-1008 (2010).
  20. Byk, T., Bar Yaacov, M., Doza, Y. N., Minke, B., Selinger, Z. Regulatory arrestin cycle secures the fidelity and maintenance of the fly photoreceptor cell. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 90, 1907-1911 (1993).
  21. Dolph, P. J., et al. Arrestin function in inactivation of G protein-coupled receptor rhodopsin in vivo. Science. 260, 1910-1916 (1993).
  22. Belusic, G., Pirih, P., Stavenga, D. G. Photoreceptor responses of fruitflies with normal and reduced arrestin content studied by simultaneous measurements of visual pigment fluorescence and ERG. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 196 (1), 23-35 (2010).
  23. Stavenga, D. G., Hardie, R. C. Metarhodopsin control by arrestin, light-filtering screening pigments, and visual pigment turnover in invertebrate microvillar photoreceptors. Journal of Comparative Physiology. A, Neuroethology, Sensory, Neural, and Behavioral Physiology. 197 (3), 227-241 (2011).
  24. Stark, W. S., Zitzmann, W. G. Isolation of adaptation mechanisms and photopigment spectra by vitamin A deprivation. Journal of Comparative Physiology. 105, 15-27 (1976).
  25. Minke, B., Kirschfeld, K. The contribution of a sensitizing pigment to the photosensitivity spectra of fly rhodopsin and metarhodopsin. The Journal of General Physiology. 73, 517-540 (1979).
  26. Cone, R. A., Cobbs, W. H. Rhodopsin cycle in the living eye of the rat. Nature. 221 (5183), 820-822 (1969).
  27. Murakami, M., Pak, W. L. Intracellularly recorded early receptor potential of the vertebrate photoreceptors. Vision Research. 10 (10), 965-975 (1970).
  28. Hodgkin, A. L., Obryan, P. M. Internal recording of the early receptor potential in turtle cones. The Journal of Physiology. 267 (3), 737-766 (1977).
  29. Yasin, B., et al. Ectopic expression of mouse melanopsin in Drosophila photoreceptors reveals fast response kinetics and persistent dark excitation. Journal of Biological Chemistry. 292 (9), 3624-3636 (2017).
  30. Hardie, R. C. Photolysis of caged Ca 2+ facilitates and inactivates but does not directly excite light-sensitive channels in Drosophila photoreceptors. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 15, 889-902 (1995).
  31. Hardie, R. C. Whole-cell recordings of the light induced current in dissociated Drosophila photoreceptors: evidence for feedback by calcium permeating the light-sensitive channels. Proceedings of the Royal Society of London. Series B, Containing Papers of a Biological Character. Royal Society (Great Britain). 245, 203-210 (1991).
  32. Ranganathan, R., Harris, G. L., Stevens, C. F., Zuker, C. S. A Drosophila mutant defective in extracellular calcium-dependent photoreceptor deactivation and rapid desensitization. Nature. 354, 230-232 (1991).
  33. Pak, W. L., Lidington, K. J. Fast electrical potential from a long-lived, long-wavelength photoproduct of fly visual pigment. The Journal of General Physiology. 63 (6), 740-756 (1974).
  34. Katz, B., Gutorov, R., Rhodes-Mordov, E., Hardie, R. C., Minke, B. Electrophysiological method for whole-cell voltage clamp recordings from drosophila photoreceptors. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (124), e55627 (2017).
  35. Selinger, Z., Minke, B. Inositol lipid cascade of vision studied in mutant flies. Cold Spring Harbor Symposia on Quantitative Biology. 53, 333-341 (1988).
  36. Minke, B., Kirschfeld, K. Microspectrophotometric evidence for two photoconvertible states of visual pigments in the barnacle lateral eye. The Journal of General Physiology. 71, 37-45 (1978).
  37. Ranganathan, R., Harris, W. A., Zuker, C. S. The molecular genetics of invertebrate phototransduction. Trends in Neurosciences. 14, 486-493 (1991).
  38. Henderson, S. R., Reuss, H., Hardie, R. C. Single photon responses in Drosophila photoreceptors and their regulation by Ca 2. The Journal of Physiology. 524, 179-194 (2000).
  39. Dimitracos, S. A., Tsacopoulos, M. The recovery from a transient inhibition of the oxidative metabolism of the photoreceptors of the drone (Apis mellifera). Journal of Experimental Biology. 119, 165-181 (1985).
  40. Agam, K., Frechter, S., Minke, B. Activation of the Drosophila TRP and TRPL channels requires both Ca 2+ and protein dephosphorylation. Cell Calcium. 35 (2), 87-105 (2004).

Play Video

Cite This Article
Gutorov, R., Katz, B., Minke, B. Electrophysiological Methods for Measuring Photopigment Levels in Drosophila Photoreceptors. J. Vis. Exp. (184), e63514, doi:10.3791/63514 (2022).

View Video